191803. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán inzulint kódoló DNS-szekvenciát tartalmazó plazmid és E. coli baktérium előállítására
1 2 zimek nagy száma ismert, és ezek könnyen beszerezhetők. Előnyösen az Aspergillus oryzaeből izolált SÍ nukleázt használjuk. Az enzim megvásárolható a következő cégtől: Miles Research Products, Elkhart, Indiana, Egyesült Államok. Ha a hajtű alakú DNS molekulát az SÍ nukleázzal kezeljük, úgy jó kitermeléssel olyan cDNS molekukálat kapunk, amelyek végein bázispárok vannak. Ezután az előzőekben megadottak szerint extrakciót, kromatográfiát és etanolos kicsapást végzünk. A reverz transzkriptáz és az SÍ nukleáz használatát az mRNS templátról leírt kétszálú cDNS szintézisekor Efstratiadis és munkatársai ismertetik (Cell, 7, 279,1976). Adott esetben növelhetjük azoknak a cDNS molekuláknak a számát, amelyek végei bázispárokból állnak, oly módon, hogy a molekulát a négy dezoxi-nukleozid-trifoszfát jelenlétében E. coli-ból származó DNS-polimeráz I enzimmel kezeljük. Az enzim exonukleáz és polimeráz aktivitása oly módon hat, hogy eltávolítja a molekula 3’-végéről a kinyúló egyszálú végeket, és ugyanakkor hozzászintetizálja az 5’-végeken lévő egyszálú részekhez a megfelelő bázispárokat. Ily módon biztosítjuk a cDNS-molekulák maximális részvételét a következő reakcióban. Az eljárás következő lépésében a cDNS termékben lévő molekulák végeit kezeljük, amiután olyan molekulákat kapunk, amelyeket a restrikciós endoriukleázok felismernek. Azt, hogy milyen DNS fragmenset kapcsolunk a molekulához, az szabja meg, hogy milyen manipulációs eszközök állnak rendelkezésünkre. A molekulához kapcsolt bázisszekvenciát azon az alapon választjuk ki, hogy milyen specifikus restrikciós endonukleázt kívánunk használni, ugyanakkor a választás attól is függ, hogy milyen a cDNS-val rekombinált DNS vektormolckula. A kiválasztott plazmidnak olyannak kell lennie, hogy legalább egy olyan hellyel rendelkezzék, ami érzékeny a restrikciós endonukleázra. így például a pMB9 plazmid egy restrikciós helyet tartalmaz a Hind III enzimre. A Hind III enzimet a Hemophilus 'influenzae-ből izoláljuk, és Smith és Wilcox módszerével (J. Mól. Bioi., 51., 379, 1970) tisztítjuk. A Hae III jelű enzimet a Hemophilus aegypticus mikroorganizmusból állítjuk elő és Middleton, Edgell és Hutchison módszerével (J. Virol, 10, 42, 1972) tisztítjuk. A Hemophilus suis mikroorganizmusból izolált Hsu I jelű enzim hasonló helyekre specifikus hidrolízist katalizál, mint a Hind III enzin. Ezt a két enzimet ezért funkcionálisan kicserélhetőnek tekintjük. A találmány szerinti eljárás egy előnyös kivitelezési változata szerint olyan kémiailag szintetizált kétszálú dekanukleotidot kapcsolunk a cDNS duplexhez, amely a Hind III enzimre érzékeny szekvenciát 'tartalmaz. A kétszálú dekanukleoíid bázissorrendjét az 1. ábrán mutatjuk be (Heynekker és munkatársai, Nature, 263, 748, 1976, és Scheller és munkatársai, Science, 196, 177, 1977). Az irodalomban több ilyen szintetikus, a restrikciós enzimek által felismert bázis-sorrend ismeretes, igy előállíthatunk többféle olyan, a kétszálú DNS végeihez kötött egyszálú DNS-t, amely egy sor restrikciós endonukleáz hatására érzékeny. A cDNS végeihez kapcsolt és a restrikciós enzimekre érzékeny molekularészt az irodalomban ismert módszerekkel köthetjük. A találmány szerinti eljárás során az úgynevezett „sérült végű ligációs reakciót végezzük, amelyet a Panet és munkatársai által kidolgozott módszer (Biochemistry, 12, 5045, 1973) szerint tisztított DNS-ligáz enzim katalizál. Ezt a reakciót Sgaramella és munkatársai írták le (Proc. Natl. Acad., Sei., USA, 67, 1468, 1970). Ennek az úgynevezett „sérült végű ligációs reakciónak a terméke, amely reakció kettős szálú, rrsérült, végekkel rendelkező cDNS molekulák és a nagy feleslegben jelenlévő kétszálú, a Hind III endonukleázra érzékeny bázis-sorrendet tartalmazó kétszálú dekanukleoíid között megy végbe, egy olyan cDNS, amely mindkét végén tartalmazza a Hind III restrikciós helyeket. Ha a reakció termékét a Hind III endonukleázzal reagáltatjuk, olyan, az 1. ábrán bemutatott molekulát kapunk, amely a restrikciós helyek hasadása következményeképpen egyszálú, az 5 -végeken egyszálú önmagával komplementer részeket tartalmaz. 4. A rekombináns DNS transzfer vektor előállítása Nagyszámú vírus vagy plazmid DNS használható a fentiekben megadott módon előállított cDNS molekulával való rekombináns képzésére. Az alapvető követelmény az, hogy az átvihető DNS molekula képes legyen belépni a gazdasejtbe, ott replikálódjon, ezenfelül hordoznia kell olyan genetikailag meghatározott tulajdonságot, amely lehetővé teszi, hogy kiválasszuk azokat a gazdasejteket, amelyekbe ez a DNS molekula belepett. A közbiztonság miatt azonban csak olyan átvihető DNS molekulát választhatunk, amely az Egyesült Államok National Institutes of Health követelményeinek megfelel (lásd előbb). Az átvihető DNS molekulák listája állandóan nő, ahogy új molekulákat fedeznek fel, amelyeket a National Institute of Health Recombinant DNA Safety Committee elfogad. A jelenleg alkalmazott előnyös átvihető molekulák között nagyszámban szerepelnek a X-bakteriofágból származók (Blatter, Williams, Denniston-Thompson, Faber, Furlong, Crunwald, Kiefer, Moore, Schumm, Sheldon és Smithies, Science, 196, 161, 1977), továbbá a col El plazmidból származók (például Rodriguez, Bolivar, Goodman, Boyer, Betlach, ICN-UCLA Symposium on Molecular Mechanisms in the Control of Gene Expression: Ed.: Nierlich, Rutter és Fox, Academic Press, N. Y., 1976,471-477. oldal). A col El-ből származó plazmidokra az jellemző, hogy viszonylag kicsik, molekulasúlyuk néhány millió, és azzal a különleges tulajdonsággal rendelkeznek, hogy az egy sejtben jelenlévő plazmid DNS molekulák száma a közönséges körülmények közötti 20-40- ről a gazdasejt klórafenikolos kezelésével 1000-re vagy többre növelhető. Megfelelő, a kísérletező szabályozásával kialakított körülmények között a gazdasejten belüli gének számának növelése lehetővé teszi, hogy a gazdasejt a plazmid génjei által kódolt elsődleges proteineket termelje. A col El ilyen származékai ezért előnyös átvihető DNS-ként jönnek számításba a találmány szerinti eljárásban. A col El előnyös származékai például a tetraciklon rezisztenciát okozó géneket hordozó pMB-9 plazmid, továbbá a pBR-313, pBR-315, pBR-316, pBR-317 és pBR-322 plazmidok, amelyek a tetraciklinnel szembeni rezisztenciát okozó géneken kívül tartalmazzák az ampicillin-rezisztencia génjeit is. A gyógyszerekkel szembeni rezisztenciát okozó gének jelenléte biztosítja azt az előnyt, hogy kivá-191 803 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 8
