191803. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán inzulint kódoló DNS-szekvenciát tartalmazó plazmid és E. coli baktérium előállítására
1 2-tiocianát, mint az oldékonyabb hidrogénklorid-só. Az ok: az előző valamivel erősebb denaturáló szer. Ha a denaturáló szerrel egy diszulfid-kötést hasító szert együtt használunk, úgy az előbbi hatása nő, mivel a diszulfid-kötéseket hasító szeT jelenléte a ribonukleáz molekulát kiegyenesíti. A tiol-származék valószínűleg növeli a denaturáció sebességét is, oly módon, hogy megakadályozza az intramolekuláris diszulfid-kötések jelenlétében bekövetkező gyors renaturációt. Ezenfelül az mRNS készítményben szennyeződésként megmaradó ribonukleáz gyakorlatilag inaktív marad, még a denaturáló szer és a tiol hiányában is. A tiolcsoportot tartalmazó és a diszulfid-kötéseket hasító vegyületek bármely koncentrációban bizonyos mértékig hatásosak, bár általában az intramolekuláris diszulfid-kötésekre számítva nagy fölöslegben kell adnunk a tioicsoportokat tartalmazó vegyületeket ahhoz, hogy a kicserélődési reakció az intramolekuláris diszulfid-kötések hasadása irányában folyjon. Másrészről több tiolvcgyület kellemetlen szagú, és nagy koncentrációban kellemetlen a velük végzett munka, így gyakorlati szempontból létezik egy felső koncentrációhatár. Hatásosnak találtuk a ß-merkaptoetanolt, a hatásos koncentráció 0,05 mól és 1,0 mól közé esik, az előnyös koncentráció a patkány hasnyálmirigy sértetlen RNS-ának izolálásakor 0,2 mól. Az mRNS sejtből való extrakciójakor az extraháló elegy pH-ja 5,0 és 8,0 közötti. A sejt-feltárás után az RNS-t elkülönítjük a sejtben lévő proteintől és DNS-től. Erre a célra több eljárást fejlesztettek ki, bármelyiket használhatjuk, mindegyik jól ismert az irodalomban. Az irodalom szerinti egyik eljárás értelmében etanolos kicsapást végzünk, az etanol szelektíve kicsapja az RNS-t. A találmány szerinti eljárás egyik előnyös kivitelezési változata szerint a kicsapási lépést kihagyjuk, és a homogenizátumot közvetlenül centrifugáló csőben lévő 5,7 mólos céziumkloridra rétegezzük. Ezután Glísin, Crkvenjakov és Byus módszere szerint (Bio' chemistry, 13, 2633, 1974) centrifugálunk. Ez a módszer azért előnyös, mert a körülmények az egész centrifugálás során nem kedveznek a ribonukleáz működésének, így az RNS jó kitermeléssel különíthető el, a termék mentes DNS-től és fehérjétől. A fentiek értelmében eljárva a sejthomogenizátumból megkapjuk a tiszta, teljes mennyiségű RNS-t. Az elkülönített RNS-nek csak egy része azonban az általunk használható mRNS. Az mRNS további tisztítása érdekében felhasználjuk azt a tényt, hogy a ntagasabbrendű szervezetek sejtjeiben az mRNS a transzkripciós lépés után további reakcióban vesz részt, nevezetesen poliadenilsavhoz kötődik. Az ilyen poliadenilsavat tartalmazó mRNS cellulóz-oligo-timidilai kromatografáló oszlopon elkülöníthető (Aviv és Leder, Proc. Natl. Acad. Sei., USA 69, 1408, 1972). A fentiek értelmében kivitelezett tisztítás elegendően tiszta, intakt és más sejtbe átvihető mRNS-f biztosít ribonukleáz enzimben gazdag kiindulási anyagból. Az mRNS fentiekben kivitelezett tisztítását és az azt követő in vitro eljárást lényegében hasonló módon végezhetjük bármely organizmusból nyert mRNS esetén is. Bizonyos körülmények között, például akkor, ha az mRNS forrása szövettenyészet sejtje, a ribonukleáz szennyeződés olyan alacsony lehet, hogy a megadott ribonukleáz-gátlást biztosító módszert nem kell alkalmaznunk. Ilyen esetekben elegendő lehet az irodalomban már ismert ribónukleáz-aktivitást csökkentő módszerek használata. 3. A cDNS elkészítése Ezen lépés elején elkészítjük a tisztított mRNS- val komplementer DNS-t. A reakciót a reverz transzkriptázzal végezzük, bár használhatunkbármely olyan enzimet, amely képes az mRNS templátból megfelelő komplementer DNS láncot kialakítani. A reakciót végezhetjük az irodalomból már ismert körülmények között, nevezetesen mRNS templát és mint a DNS nrolekula prekurzorai, a négy dezoxi-nukleozid-trifoszfát jelenlétében. Előnyös, ha az egyik dezoxi-nukleozid-trifoszfátot az a-helyzetű foszfornál izotóppal jelöljük (P23), ily módon követhetjük a reakciót, az elkülönítési eljárás, például a kromatográfia vagy az eiektroforézis után vizsgálhatjuk a terméket, továbbá mennyiségi szempontból becsülhetjük a vegyület visszanyerését (Efstratiadis, Kafatos, Maxam cs Maniatis, Cell, 7, 279, 1976). Ahogy azt az 1. ábrán látjuk, a reverz transzkriptáz enzimmel katalizált reakció terméke egy kétszálű, hajtűhöz hasonló alakú molekula, írói az RNS és a DNS szálak között nem-kovalens kötések létesültek. A reverz transzkríptáz enzimmel végzett reakció terméket az irodalomban ismert módszerekkel különítjük el a reakcióelegyből. Használhatjuk a fenolos extrakciót, de izolálható a termék a Sephadex G-10 gyantával (Pharmacia Inc., Uppsala, Svédország) végzett kromatográfiával vagy etanolos kicsapássaí, vagy ezen módszerek kombinációjával. Amikor a cDNS-t enzimatikus szintézissel előállítottuk, az RNS templátot eltávolíthatjuk. Az irodalomban több módszer ismeretes az RNS bontására DNS jelenlétében. Előnyös módszer az alkálikus hidrolízis, amely igen szelektív és a reakcióelegy pH-jának beállításával könnyen szabályozható. Az alkálikus hidrolízis után semlegesítjük a reakcióelegyet, majd a P3 2-jelzett cDNS-t adott esetben etanolos kicsapással töményítjük. A kétszálú, hajtű alakú cDNS szintézisét megfelelő enzimmel, mint például DNS-polimerázzal vagy reverz trjnszkriptázzal katalizált reakcióval végezzük. A reakciót az előző reakció kapcsán megadottak szerint végezzük, beleértve az OrP32-jelzett nukleozid-trifoszfát használatát is. A reverz transzkríptáz enzimet több helyről izolálhatjuk. A legelőnyösebb enzim forrás a madarak mieloblasztózis vírusa. A vírust dr. Beard-tól kaptuk (Lipe Science Incorporated, St. Petersburg, Florida, Egyesült Államok), aki a vírust a National Institutes of Healt felügyelete datt állította elő. A cDNS előállítása után előnyösen elkülönítjük azt a reakcióelegyből. Ahogy azt az előbbiekben ismertettük, az izolálást fenolos extrakcióval, Sephadex G-100 gyantával készült oszlopon kivitelezett kromatográfiával vagy etanolos kicsapással végezzük. Az így kapott DNS nem tartalmaz szennyező fehérjét. Az így előállított DNS-hajtű-szerű szerkezete átalakítható az ismert kétszálú szerkezetté oly módon, hogy eltávolítjuk a molekuláról a komplementer szálak végeit összekötő egyszálú hurkot. A DNS kétszálú szakaszainak speciális hidrolízisét végző en191 8C3 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 7
