191803. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán inzulint kódoló DNS-szekvenciát tartalmazó plazmid és E. coli baktérium előállítására
1 2 datból. Ezután jó kitermeléssel a kémiailag szintetizált dekanukleotidhoz való kapcsoláshoz szükséges, végükön bázispárokat tartalmazó cDNS molekulákat kapunk. A Hind III dekanukleotidok előállítására Scheller, Dickerson, Boyer, Riggs és Itakura módszere szerint (Science, 196, 1977) járunk el. A . Hind III dekanukleotidok és a cDNS összekapcsolását 14°C-on való inkubációval végezzük a következő reakcióelegyben : 66 mmól/1 trisz-hidrogénklorid, pH 7,6, 6,6 mmól/1 magnéziumklorid, 1 mmól/1 ÁTP, 10 mmól/1 ditio-treitol, 3 mmól Hind III dekanukleotid (1Û5 cpm/pmól) és 500 E/ml T4 DNS-ligáz. Az inkubációt egy órán át végezzük. Ezután a ligáz enzim inaktiválására 5 percen át 65°C hőmérsékleten tartjuk a reakcióelegyet. Végkoncentrációra számolva a következő vegyületeket adjuk az elegyhez: 50 mmól/1 káliumklorid, 1 mmól/1 p-merkaptoetanol és 0,1 mmól/1 EDTA. Ezután 2 órán át 37°C hőmérsékleten 150 E/ml Hsu I vagy Hind III endonukleázzal emésztjük a terméket. A Hind III vagy a Hae III endonukleáz beszerezhető az Egyesült Államokban: New England Bio-Labs, Beverly, Massachusetts. Az előállított terméket az 1. példában megadott módon gélelektroforézissel analizáljuk. 450 nukleotidból álló tennék jelenlétére utaló sávot figyelhetünk meg, a hasított Hind III dekapeptidek fragmensein kívül. 4. példa Ismertetjük a rekombináns plazmid létrejöttét és a replikációt követően jellemezzük. A Rodriguez, Boliver, Goodman, Boyer és Betlach által megadott módon (ICN-UCLA Symposium on Molecular and Cellular Biology, kiadó: Wierlich, Rutter és Fox, Academic Press, New York, 1976, 471-477. oldal) előállított pMB-9 DNS-plazmidot a Hind III restrikciós szakaszon Hsu I endonukleázzal hasítjuk, majd alkálikus foszfatázzal kezeljük (BAPF típus, Worthington Biochemical Corporation, Freehold, New Jersey, Egyesült Államok). Az enzim koncentrációja a reakcióelegyben 0,1 E//ag DNS, a reakcióelegyet 8,0 pH-jú 25 mmól/l-es trisz-hidrogénklorid pufferban inkubáljuk 30 percen át 65°C hőmérsékleten, majd a foszfatáz eltávolítására fenollal extraháljuk. Etanollal kicsapjuk a reakcióelegyből a foszfatázzal kezelt plazmid DNS-t, majd Hind III kohézív végeket tartalmazó cDNS-hez adjuk 3 mól plazmid: 1 mól cDNS arányban. 7,6 pH-jú 66 mmól/l-es trisz-hidrogénklorid pufferban inkubáljuk a DNS-t, a reakcióelegy 6,6 mmól/1 magnéziumkloridot 10 mmól/1 ditio-treitolt és 1 mmól/1 ATP:t tartalmaz, az inkubációt egy órán át 14 C hőmérsékleten végezzük 50 E/ml T4 DNS-ligáz jelei.létében. A reakcióelegyet az inkubáció befejezése után az alábbiakban megadott módon előkészített E. coli X-1776 sejtekhez adjuk. 50 ml, az alábbiakban megadott összetételű táptalajon 2x10® sejt/ml sejtkoncentrációig növesztjük a tenyészetet: tripton 10 g/1: élesztőkivonat 5 g/1, nátriumklorid 10 g/1, nátriumhidroxid 2 mmól/1, diamino-pimelinsav 100 jug/ml és timin 40 pg/tni. A tenyésztést 37°C hőmérsékleten végezzük A tenyésztés befejezése után 5 C hőmérsékleten 5000 g nehézségi gyorsulás mellett 5 percen át centrifugáljuk a sejtszuszpenziót, az üledéket 20 ml 10 mmól/l-es hideg nátriumklorid oldatban szuszpendáljuk. Megismételjük a centrifugálást, majd a következő összetételű 20 ml térfogatú transzformációs pufferban szuszpendáljuk a sejteket: 75 mmól/1 kalciumklorid, 140 mmól/1 nátriumklorid és 10 mmól/1 trisz-hidrogénklorid, pH 7,5. 5 percen át jégfürdőben tartjuk a sejtszuszpenziót. Ezután újra centrifugáljuk a sejteket, majd 0,5 ml a fenti összetételű transzformációs pufferban szuszpendáljuk. A transzformációra 100 ß ilyen sejtszuszpenziót 50 Iá rekombináns DNS-val keverünk (1 /Jg/ml). 15 percen át 0°C hőmérsékleten inkubáljuk a keveréket, majd 4 percen át 25°C-on, végül 30 percen át 0°C hőmérsékleten folytatjuk az inkubációt. Ezután a megfelelő szelekciós körülmények között agar-Iemezekre szélesztjük a sejteket. A rekombináns piazmidok kutatására, azaz a Hind III szakasz transzformációjának kimutatására 5 pg/ml tetraciklint használunk. Ily módon egy pAU-1 jelű rekombinánst izoláltunk. A pAU-1 rekombinánsból izolált 2 jJg-5 ng DNS plazmid-készítményt emésztünk, Hsu I endonukleáz fölöslegével. Ezután a végkoncentrációra számolva 10 mM EDTA-Na2-t és 10% (súlyszázalék) szaharózt adunk a reakcióelegyhez, majd 8% poliakrilamid gélen szétválasztjuk az elegyet. Az elektroforézises vizsgálat szerint a DNS a 410 bázispárnak megfelelő helyen található. A fenti kísérletet pBR-322 plazmiddal megismételjük. Mindent a fentiekben megadottak szerint végzünk, kivéve a rekombináns telepek szelekcióját, amit 20 jug/ml ampicillint tartalmazó lemezeken végzünk. 5. példa Izoláljuk az ember inzulinjának megfelelő nukleotid-sorrendű nukleinsavat, tisztítjuk, és plazmidba építjük lényegében az 1-4. példában megadottak szerint eljárva. Kiindulási anyagként az ember hasnyálmirigyének szöveteit választjuk, amit megfelelő emberi anyagból, mint például önként felajánlott hasnyálmirigyből, friss hullából vagy emberi inzulinoméból izolálunk. Gyakorlatilag a 4. példában megadottak szerint előállítunk egy mikroorganizmust, amely olyan nukleotid-sorrenddel rendelkezik, amely az emberi inzulin A és B lánc aminosav-sorrendjét kódolja. Az ember inzulin A láncának aminosav-sorrendje jelenlegi ismereteink szerint a következő:! 10 Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Th^er-Be-Cys-Ser-Leu-T y r-Glu-Leu-Glu-Asn-T yr-Cys-Asn. Az ember inzulin B láncának jelenleg ismert aminosav-sorrendje pedig a következő: 0 Phe-Val-Asn-Glu-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Çÿs-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe -Phe -T y r-Thr -Pro-Ly s-Thr. Az aminosav-sorrendben a számozást a szabad aminocsoportot tartalmazó végtől kezdtük el (Smith, Diabetes, 21 (2), 458,1972). SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás humán inzulint kódoló génnek Escherichia coli-ba . történő transzformálására alkalmas plazmid előállítására, azzal jellemezve, hogy 191 8C3 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 12
