191803. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán inzulint kódoló DNS-szekvenciát tartalmazó plazmid és E. coli baktérium előállítására

1

2

191 803

(1) inzulint kódoló mRNS-tart almazó sejteket izolálunk emberi hasnyálmirigyből oly módon, hogy- Langerhans- és más sejteket tartalmazó hasnyálmirigy-szövetet egy hidrolízist katalizáló enzimmel és tripszin-inhibitorral kezelünk, majd- a kapott szövet-készítményt frakcionáljuk, célszerűen centrifugálással,

(2) a kapott, más sejtekből és seittöredékektől mentes Langerhans-sejtekből az mRNS-t kaotrop kationt, kaotrop aniont és diszulfid-kötést hasító szert tartalmazó ribonukleáz-gátló szer jelenlétében extrabáljuk.

(3) az elválasztott mRNS-t dATP, dCTP, dGTP és TTP jelenlétében egy reverz transzkriptázzal inkubáljuk,

(4) az így szintetizált, inzulint kódoló cDNS-t, dATP, dCTP, dGTP és TTP jelenlétében egy reverz transzkriptázzal vagy egy DNS polimerázzal inkubáljuk.

(5) az így nyert kétszálú cDNS végeihez önmagában ismert módon olyan kapcsoló DNS láncot kapcsolunk, mely komplementer valamely E. coli plazmid restrikciós endonukleázzal végzett hasítása után keletkezett láncvégekkel.

(6) valamely E, coliból eredő plazmidot egy restrikciós endonukleázzal hasítunk és a hasított plazmidról alkalikus foszfatázzal eltávolítjuk az 5 -terminális foszfát-csoportot, és

(7) a kapcsoló DNS-szekvenciát tartalmazó kétszálú DNS-láncot és a kezelt plazmidot egy DNS-ligáz és ATP jelenlétében inkubáljuk. (Elsőbbsége: 1977. 05.27.)

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal j e 1 lern e z v e, hogy az (1) lépésben hidrolitjkus enzimként kollagenáz-készítményt alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1977.05.27.)

3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az enzimes kezelést szilikonnal kezelt üvegedényben végezzük. (Elsőbbsége: 1977.

05.27. )

4. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az enzimes kezelést műanyag edényben végezzük. (Elsőbbsége: 1978.04.26.)

5. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal j e 11 em ez v e, hogy a (2) lépésben olyan ribonukleázgátló szert alkalmazunk, mely kaoptrop kationként guanidium-iont és kaotrop anionként tiocianát-iont tartalmaz. (Elsőbbsége: 1977.05.27.)

6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jelleme zve, hogy a (2) lépésben diszulfid-kötést hasító szerként ß-merkapto-e tanolt használunk. (Elsőbbsége: 1977.05.27).

7. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal j e 11 e - m ez v e, hogy a (2) lépésben olyan ribonukleáz-gátló szert alkalmazunk, mely 4 m guanidinium-tiocianátot és 0,2 m c-merkapto-etanolt tartalmaz. (Elsőbbsége: 1078.04.26.)

8. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a (6) lépésben E. coli plazmidként pBR322 plazmidot alkalmazunk. (Elsőbbsége:

1977.05.27. )

9. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal j e 1 lern e z v e, hogy a (6) lépésben E. coli plazmidként pMB-9 plazmidot alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1977.

05.27. )

10. A 8. vagy 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a (6) lépésben az E. coli plazmidot Hind ül, Hsul vagy EcoRI endonukleázzal hasítjuk pH = 7,6 értéknél, 37°C hőmérsékleten. (Elsőbbsége: 1977.05.27.)

11. Eljárás humán inzulint kódoló nukleotid szekvenciával rendelkező Escherichia coli baktérium előállítására, azzal j e 1 1 e m ez v e, hogy az 1-10. igénypontok bármelyike szerint előállított plazmidot E. colival inkubáljuk. (Elsőbbsége: 1978. 04. 26.)

5

10

15

20

25

30

35

1 db rajz

Kiadja: Országos Találmányi Hivatal Felelős kiadó: Himer Zoltán o.v.

KÓDEX,

13