191746. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új, a vér koleszterin szintjét csökkentő fehérjék és az ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmény előállítására
1 19! 746 2 1 .Farmakológia) hatások Mint azt az alábbi példák mutatják, a találmány »zerinti CRP fehérjéből felépülő atherosclerosis ellenes gyógyszer különlegesen hatékonyan csökkenti emlősök vérkoleszterin szintjét Ennek megfelelően ez a gyógyszer az atheroselerosishoz, hiperlipídémiához, hiperlipoproteínémiálioz, xantomatozishoz, kolecistoliOázishoz, nragas vérnyomáshoz, cukor - beiegségltez szorosan kapcsolódó betegségek terápiás vagy preventív gyógyszerként használható. A találmány szerinti készítményt emlősökbe orálisan, interajieritoneálisan, intravénásán vagy egyéb módokon juttathatjuk. Alkalmanként I jug lg gyógyszert adhatunk testkilogrammonként. Orális kezelés esetén 0,1 mg - 100 mg/testsúly kg anyag adása előnyös. A találmány szerinti anyagot bármilyen formában használhatjuk, például fiziológiás sóoldatban vagy egyéb folyadékokban oldva, injekcióként, liofilizáll porként, kúpként, külső bevonattal ellátott tablettaként,«zubiinguális tablettaként, granulátumként, tablettaként, kapszulaként megfelelő vivőanyagokkal (például keményítő, dextrin), hígító bázisokkal (például kalcium-karbonát, laktóz), oldószerekkel (például fiziológiás sóoldat, desztillált víz.) stb. együtt. 2. Akut toxícitás Mint azt az alábbi példák mutatják, a találmány szerinti CRP protein LDstí értéke nagyobb, mint 802 mg/testsúly kg inlraperitoneálisan adagolva egerek esetén. Az anyag lényegében nem toxikus orális kezelés esetén. A találmányt az alábbi példákkal illusztráljuk anélkül,hogy találmányunkat a példákra korlátoznánk, 1 példa A CRP fehérje előállítása és tisztítása Streptococcus íaecium ADV1009 (FHRM Bp-196) törzset 2 1 Rogosa táptalajra oltottunk úgy', hogy a mikroorganizmus végső koncentrációja 1x10* baktérium sejt/ml volt. A beoltott közeget 37 "C-on 10 órán keresztül keverés nélkül aerob körülmények között inkubáltuk. így 109 baktérium sejt/ml koncentrációjú tápközeget kaptunk. A baktérium sejteket 12.000 fordulat/perc sebességű folyamatos centrifugázással gyűjtöttük össze, fiziológiás sóoldattal (0,85 s% nátrium-klorid) mostuk, és fiziológiás sóotdatban szuszpendáítuk. Így 100 ml, 2x10'° baktérium sejt/ml koncentrációjú szuszpenziót nyertünk. A fenti baktérium sejt szuszpenziót 115 X-on 10 percen keresztül hőkezeltük, és a zsírok eltávolítása céljából háromszor mostuk kloroform-metanol 2: l téríogatarányú elegy ében. A zsírtalanított baktérium szuszpenziót 3000 forduiat/perc sebességgel 10 percen keresztül centrifugáztuk, és az alsó, vagyis a kloroformos fázist eldobtuk. A vizes fázist használtuk a következő tisztítási lépések kiindulási anyagaként. A kiindulási anyagot ezután 100 ml foszfát-pufferben (pH* 7$) oldott 20 m£ pronázzál (XIV. típus /sigina/proteáz) kezeltük 47 X-on 24 órán keresztül, mely oldat 0,0015 mól kalcium-kloridot is tartalmazott, majd 10 mg további pron ázzál kezeltük ugyanilyen körülmények között. A pronázos kezelés kísérleti körülményeit a Methods in Fjtzymology (1966) VII!. kötetének 26. oldala írja le. A pron ázzál kezelt anyagot két fázisra választottuk szét 3000 fordulat/percen való 10 perces centrifugál ássál. A felszínen úszó frakcióhoz 1/9 térfogatrész 100 s/tf,%-os triklór-ecetsavat (TCA) adtunk, 3 ó án keresztül 4 °C-on kevertettük és 3000 fordulat/ /perc sebességgel 10 percen keresztül centrifugáztuk, így két fázist, egy felülúszó és egy csapadék frakciót kaptunk. A csapadék frakcióhoz vele megegyező térfogatú 10%-os TCA-t adtunk, ás megismételtük az előző eljárást. A kapott csapadékot háromszor etil-éterrel mostuk, hogy eltávolítsuk a triklór-ecetsavat, Í0 ml desztillált vízben mostuk, 1 n nátríum-hidroxid oldattal semlegesítettük, a triklór-ecetsav teljes eltávolítása érdekében dializáJtuk, majd végül centrifugálissal 345 mg szárazsúlyú csapadék frakció végterméket nyertünk. A kapott 345 mg csapadék frakciót 5 ml triszaoetát puffer (pH- 8), 1 ml 0,1 M magnézium-aeetát ás 0,06 ml dezoxi-ribonukleáz [2 mg/ml dezoxi-riborukleáz 1 (Signra)] keverékéhez adtuk és 37 °C-on 1 órán keresztül inkubáltuk. Ezután a reakciókeveréket víz ellenében dializáltuk cellulóz csőben, anrely olyan anyagokat díalizál, amelyek mólsúlya kisebb, mint 3500 (Cellotube, Nakarai Kagakuyakubin Co„ Ltd., Japán), 3 napon keresztül. A dializált frakciót szárazra pároltuk. A kapott anyagot ezután 440 egység T2 ribonukleázt (Sigma) tartalmazó 0,05 Mos aoetát pufferben (pH= 4,6) szuszpendáltuk, 37 °C-on 3 órán keresztül inkubáltuk és desztillált víz ellenében dializáltuk. A dializált frakciót,melynek mólsúlya nagyobb volt, mint 20.000, 1. sz. tisztított frakciónak neveztük (száraz súly; 285 mg). A fenti I. számú tisztított frakciót ismét Ti ribonukleázzal kezeltük és dializáltuk. Így a lí. számú tisztított frakciót kaptuk, melynek száraz súlya 274 mg volt. Ezt a 11. számú frakciót egy Toyopearl Í1W 55 oszlopkromatográfra vittük fel, melyet 0,3 mól nátrimu-kloridot tartalmazó 25 miliimólos trisz-sósav pufferrel (pH= 7,5) egyensúlyoztunk ki. A II. számú frakció oszlopkromatogramját 1 ml/perc éludés sebességnél a 2. ábra mutatja. Az „A” vonal 280 nm abszorbanciánál mutatja a protein tartalmat, a ,.B” vonal 260 nrn abszorbandánál mutatja a nukleinsav tartalmat, a „C” vonal a fenol-kénsavas módszerrel mért cukortartalmat jelzi. Azt a frakdót,amely a 2. ábrán a D vonalnál később eluálódoft (eludós térfogat 67 ml) 55%-os telítettségű ammónium-szulfát oldattal kezeltük, és az ammónium-szulfátos frakcionálási folyadék felső fázisából nyertük ki a III. számú tisztított frakdót (száraz súly:205,5 mg). A 3. ábra a III. számú tisztított frakdó oszlopkromatogramját mutatja az előzőekben leírtakkal azonos körülmények között. Mivel a III. számú frakdó nyomnyi mennyiségű cukrot tartalmaz, a frakdót háromszor 10%-os tríklór-ecefsawa! kezeltük és az előzőekben leírtakkal azonos körülmények között dializáltuk, így a végtermék CRP proteint kaptuk (száraz súly: 197,3 mg). A 4. ábra mutatja a végtermék CRP fehérje oszlopkromatogramiát, amelyet a 2. és 3. ábra felvételével azonos körülmények között vettünk fel. A CRP fehéije fizikai kémiai tulajdonságait a fentiekben Ismertettük. A 4. !áMí;,at a Lowry módszerrel kapott protein, az ordnol módszerrel kapott RNS, a difenil-aminos módszerrel kapott DNS és a fenol-kénsavas mód-6 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 5
