191743. lajstromszámú szabadalom • Eljárás antraciklin szerkezeti típusú antibiotikumok előállítására
1 2 kicsapjuk a daunomicin-hidrokloridot. A terméket leszűrjük és n-hexán-aceton (6 : 4) eleggyel mossuk, majd foszfor-pentoxld felett vákuumban szárítjuk. Így 1,55 g daunomicin-hidrokloridot kapunk, mely kevés szabad bázist is tartalmaz. Ezt feloldjuk 15,5 ml dioxán-víz (8 : 2) elegyben, melyhez előzőleg a szabad daumicin bázis tartalommal ekvivalens tömény sósavat adagolunk. Az így nyert oldathoz 120 ml vízmentes dioxánt adunk. Az elegyet egy napig kristályosítjuk 20°C-on. Ezután a kristályokat leszűrjük, n-hexán-aceton (6 : 4) eleggyel mossuk és foszforpentoxid felett vákuumban szárítjuk. így 1,12 g tiszta daunomicin-hidrokloridhoz jutunk (hozam 70%). Op.: 188-189°C. Elemanalízis: C% H% N% -cr% mért: 56,32 6,14 számított: 57,15 5,32 2,41 2,48 5,80 6,29 UV színkép (96%-os etanol): \naxnm 233 250 287 492 529 Elcm 637 438 158 202 106. IR színkép (KBr): kOH (asszociált) 3650-3160, i^NH'3+, rC-H. rOH (kelátban) 3160-2300, r<C=0 1713, íOO (kelátban levő kinon) 1615 és 1580, iC-O-C 1285 cm'1. 1H-NMR spektrum: (CDC13 - 20% DMSO - d6' 6/1,27 d, 3H (CH3-5 ), 2,35 s, 3H (H3-14), 4,01 s, 3H (CH30), 5,03 bs, 1H (H-10), 5,42 bs, 1H (H-l,), 7.3-8,0 m, 3H (H-2, H-3, H4), ppm. 13C-NMR spektrum: (DMSO-d6: Referens az oldószer jelcsoportjának középső vonala: 5 =41,4 ppm): Jellemző sávok (6): 18,4 (CH3-5), 25,8 (C-14), 48,5 (C-3 ), 76,9 (C-8), 100,4 (C-l ), 162,5 (C-l), 187,9,188,0 (C-5, C-l2) ppm. A daunorubicinolt tartalmazó oszlopkromatográfiás frakciókat egyesítjük és vákuumban 2 ml-re besűrítjük. A sűrítményhez 3 ml kloroformot adunk, és 15 ml n-hexánnal kicsapjuk a daunorubicinol-hidrokloridot. A terméket leszűrjük és n-hexán-aceton (6 : 4) eleggyel mossuk, majd foszfor-pentoxid felett vákuumban szárítjuk. így 160mgdaunorubicinol-hidrokloridot kapunk, mely kevés szabad bázist is tartalmaz. Ezt feloldjuk 2 ml dioxán-víz (8 : 2) elegyben, melyhez előzőleg a daunorubicinol bázis tartalommal ekvivalens tömény sósavat is adagoltunk. Az így nyert oldathoz hozzáadunk 15 ml vízmentes dioxánt. Az elegyet egy napig kristályosítjuk 20°C-on, ezután a kristályokat leszűrjük, n-hexán-aceton (6 : 4) eleggyel mossuk, és vákuumban szárítjuk. így 120 mg tiszta daunorubicinol-hidrokloridot kapunk. Op.: 218—222°C. A vcgyület UV és IR spektruma megegyezik a 19 11 240 számú Német Szövetségi Köztársaságbeli közrebocsátási iratban közölttel. Daunomicin bázis előállítása daunomicin-hidrokloridból 0,1 g kristályos daunomicin-hidrokloridot oldunk 20 ml desztillált vízben. Az oldatot 1 n nátriumhidroxiddal pH = 8,5-re lúgosítjuk, majd háromszor 10 ml kloroformmal extraháljuk. A kloroformos kivonatot vízmentes nátriumszulfáton szárítjuk, majd csökkentett nyomáson 1—2 ml-re besűrítjük. A sűrítményből 20 ml petroléterrel (fp: 40-70”C) kicsapjuk a bázist. Szűrés után foszfor-pentoxid felett vákuumban szárítjuk a terméket. így 85 mg daunomicin bázist kapunk. A terméket kloroform-metanol (80 :20) elegyben futtatjuk. Adszörbensként . Kieselgél G és Kieselgél 60 HFjr^gg 1 : 1 arányú keverékét (Reanal) használjuk. A réteg 0,2 mm vastag. Rf = 0,19. 2. példa A Streptomyces coerulescens (MNG 00200) 1. példában leírt módon készített 100 ml Dl-jelű inokulum tenyészetével beoltunk 10 literes laboratóriumi üvegfermentorban 90 percig 121°C-on sterilezett 5 liter DT. jelű táptalajt, A tenyésztést 28°C- on, 500-as fordulatszámú keverés és 5 liter/perces levegőztetés mellett végezzük. Fermentáció folyamán szükség szerint steril 3A-jelű habzásgátló készítményt (Chinoin) adagolunk a tenyészethez. A tenyészet a fermentáció 120. órájában 130 Mg/ml daunomicint tartalmaz. 5 liter 130 /Lig/inl daunomicin-tartalmú fermentléhez keverés közben hozzáadunk 135 g oxálsavat. A fermentlevet egy órán át 45-50°C-on kevertetjük. Utána leszűrjük, és a micéliumot 1,5 liter vízzel alaposan kimossuk. A szürletet és a mosó folyadékot egyesítjük, majd 5 °C-ra hűtjük és 5n nátrium-hidroxiddal pH = 8,5 -re lúgosítjuk. Az így nyert oldatot háromszor 1,25 liter n-butanollal extraháljuk. Az egyesített butanolos extraktum pH-ját tömény sósavval 4-re állítjuk, majd az extraktumot 25Ó mire besűrítjük, ezután a sűrítményhez 250 ml n-hexánt adunk. A n-hexán-butanol elegyet háromszor 250 ml 0,1 n sósav oldattal kivonatoljuk. A kapott sósavas vizes kivonat tartalmazza a daunomicint és a daunorubicinolt, a szerves fázis pedig az aglükonokat és bioszintizésük intermedierjeit. A vizes kivonatot 2 n nátriumhidroxiddal pH » 8,5-re lúgosítjuk, majd háromszor 250 ml n-butanollal extraháljuk. Ezután az egyesített butanolos extraktumot 5 n sósav oldattal pH = 3,5-re savanyítjuk, és 20 ml-re bepároljuk. A kapott sűrítményhez 0,25 ml desztillált vizet adunk, és a sűrítmény pH-ját 2n sósavval 1,3-ra állítjuk. Ezután n-hexán-aceton (1 : 1) eleggyel kicsapjuk az antibiotikum komplex hidroklorid-sóját. A csapadékot leszűrjük, majd foszfor-pentoxid felett vákuumban szárítjuk. így 0,76 g nyersterméket kapunk. A nyerstermékben lévő daunomicin-hidrokloridot és daunorubicinol-hidrokloridot az 1. példában leírt módon szilikagél-oszlopkromatográfiával választjuk szét, és kristályosítjuk át. Ilyen módon 390 mg tiszta daunomicin-hidrokloridhoz és 35 mg tiszta daunorubicinol-hidroklorídhoz jutunk. A daunomicin és a daunorubicinol kivonása után visszamaradó hexán-butanol elegyet 25 ml-re besűrítjük, és a sűrítményhez 200 ml die til-étert adunk. Az éter hatására kiváló csapadékot leszűrjük, és a kapott 1,35 g súlyú aglükön-keveréket 50 g szilikagélből készített oszlopon (magasság-átmérő arány = 6) kromatografálva elválasztjuk. Az oszlop leoldását 50% kloroform tartalmú kloroform-n-hexán eleggyel kezdjük, majd 10%-os fokozatokban növeljük az eluáló elegy kloroform tartalmát, ezt követően tiszta kloroformmal, majd 5% metanol tartalmú kloroformmal végezzük az eluációt. A 8-acetil-l-metoxi-7,8,-9-9,10-te trahidro-6,8,11 -trihldroxi-5,12-n aftacéndion 10% n-hexán tartalmú kloroformmal, a 8-acetíl-l-metoxl-7,8,9,10-tetrahidro-6,8,10,11 -te trahidroxi-191 743 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 5
