191697. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új, a vér triglicerid-szintjet csökkentő poliszacharid és az ezt tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 2 191.697 rium-hidroxid oldattal semlegesítettük, a triklórecetsav teljes eltávolítása érdekében dializáltuk, majd végül liofilizálással 345 mg szárazsúlyú felül- 5 úszó frakció végterméket nyertünk. A kapott felülúszó frakciót a fenti pronázzal kezeltük és dializálás után 176 mg szárazsúlyú (mól súly > 35000) dializált frakciót nyertünk. A dializált frakciót I. sz. tisztított frakciónak nevezzük. A fenti I. sz. tisztított frakciót Sephadex G-100 (Pharmacia) oszlopon kromatografáltuk, mely oszlopot 0,05 M trisz-sósav pufferrel egyensúlyoztunk ki. Az I. sz. tisztított frakció oszlopkromatogramját 1 ml/perc eluciós sebességnél a 2. ábra mutatja. Az abszcissza az eluciós térfogatot (ml), az ordináta az ^ eluált anyag koncentrációját (jug/ml) mutatja. 124 ml anyag átáramlása után a frakciókat összegyűjtöttük és II. sz tisztított frakciónak neveztük el, melynek szárazsúlya 93,6 mg volt. A 3. ábra a 11. sz. tisztított 0,3 M nátrium-kloridot tartalmazó frakció 25 millimólos trisz-sósav puf- 20 ferrel kiegyensúlyozott Toyopearl HW-55F oszlopon meghatározott kromatogramját mutatja. Az eluciós sebesség 1 ml/perc volt. A 3. ábrán az 1., 2. ill. 3. vonal a cukor, a protein és a nukleinsav eluciós profilját mutatja. A 87,9 mg szárazsúlyú tisztított TRS poliszacharidot a 80-100 ml térfogatú frakciók összegyűjtésével nyertük. A 4. ábra a 3. ábrával megegyező körülmények között felvett, a TRS poliszacharid oszlopkromatogramját mutatja. S TRS poliszacharid fizikai-kémiai tulajdonságait a fentiekben ismertettük. A 4. táblázat a Lowry módszerrel meghatározott protein, az orcinol módszerrel kapott RNS, a difenil-aminos módszerrel kapott DNS és a fenol-kénsavas módszerrel kapott cukor mennyiségét és kitermelését tartalmazza mindegyik eljárás esetén. A táblázatban az értékek száraz súlyokat (mg) ill. súly %-ot jelentenek. 3. táblázat Frakciók Kitermelés Protein RblS DW Cukor Specifikus aktivitás Felülúszó 1471 i.s ... nyomokban ~7?T,3 7,1 I. sz. tisztított frakció 176 2,8 1,6 nyomokban 95,6 10,2 11. sz. tisztított frakció 93,6 2,1 0,9 nyomokban 97,0 12,3 TRS poliszacharid -87,9 nyomokban nyomokban nyomokban 100 23,0 A 3. táblázatban jelzett specifikus aktivitás az egyes frakciók triglicerid-szint csökkentő relatív aktivitását mutatják közönséges patkányok egységsúlyára számítva, ha a hőkezelt baktériumsejtek triglicerid-szint csökkentő hatását 1-nek tekintjük. A hipotrigliceriális aktivitás meghatározására alkal- <jij mázott kísérleti módszereket a 2. példában ismertetjük. 2. példa A TRS poliszacharid farmakológiai hatása 1) Hipotrigliceridémiás aktivitás (1) 40 16 mg/testsúly kg-nyi mennyiségnek megfelelő liofilizált TRS poliszacharidot tartalmazó fiziológiás sóoldatos mintákat készítettünk. Ezekből a mintákból közönséges patkányoknak (18 hónapos hím, átlagos testsúly 246 g, mindegyik csoportban 10 patkány) és közönséges és sterilizált egereknek 45 (18 hónapos hím, átlagos testsúly 30 g, 10 egér minden csoportban) naponta 1 ml-t adtunk orálisan. Az egereket és patkányokat 8—12 hétig tartottuk megfigyelés alatt. Ezután ezeknek az állatoknak az artériás vérét az abdominális aortából lecsapoltuk és a szérum mintákat centrifugálással választottuk ^ el a teljes vérből. A triglicerid-szintet Trygliceride TG WAKO (Wako Junyake Co., Ltd.)-val, acetil-acetonos módszerrel határoztuk meg. Az eredményeket a 4. táblázat összegezi. A táblázatban felsorolt értékek a kezelt csoportok vérének 55 a triglicerid-szintjének a kontroll csoport, amely nem kapott TRS poliszacharidot, vérének triglicerid szintjéhez viszonyított csökkenését (%) jelzik. A tetszés szerinti mennyiségben adott élelem százalékos összetételét az 5. táblázat mutatja. 4. táblázat Állat Csökkenési arány (%) Közönséges patkány (12 hetes kezelés) 40,5 Közönséges egér (8 hetes kezelés) Sterilizált egér 45,1 (8 hetes kezelés) 39,6 5. táblázat összetétel Súly % Kazein 20 Szójaolaj 10 Búzakeményítő 61 Ásványi anyagok 4 Vitamin keverék 2 Porított szűrőpapír 2) Hipotrigliceridémiás aktivitás (2) 3 A fent említett mintákat naponta 1 ml-es dózisban adagoltuk közönséges patkányoknak (18 hetes, átlagos testsúly 238 g, minden csoportban 15 patkány) és közönséges és sterilizált egereknek (18 hetes, hím, átlagos testsúly 31 g, 10 egér minden csoportban) 12 héten keresztül. A vértrigliceridet a fentiekben említett módszer szerint határoztuk meg. Az eredményeket a 6, táblázat tartalmazza. „koleszterinnel terhelt és a „fruktózzal terhelt kifejezés a táblázatban azt jelenti, hogy a fenti táplálékhoz 1% koleszterint adtunk, illetve a búzakeményítőt teljes egészében fruktózzal helyettesítettük. A táblázatban található értékek a nem kezelt csoporthoz viszonyított koleszterin-szint csökkenést jelentik 9£*ban kifejezve. 5
