191697. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új, a vér triglicerid-szintjet csökkentő poliszacharid és az ezt tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 2 191.697 pearl HW 55 oszlopot (Toyosoda Co., Ltd.) használva, melyet 0,3 mól nátriumkloridot tartalmazó 25 millimólos Tris-HCl pufferral, (pll = 7,5), egyensúlyoztunk ki. 3) Specifikus forgatókép A TRS poliszacharid specifikus forgatóképessége 1,8 súly/tf%-os oldatban [a]^9 =+190,1 (dextrarotáció), melyet DIP-4 típusú (Japan Spectroscopic Co., Ltd) polariméterrel határoztuk meg. 4. Cukorösszetétel a) A minta 4 g-ját 0,2 mólos trifluor-ecetsavval (TFA) kezeltük 100°C-on 7 órán keresztül, majd a következőképpen trimetil-szilileztük, a mintát 0,2 ml hexametil-diszilazánnal (20 tf%-os piridines oldat) és 0,02 ml trimetil-klórszilánnal kevertünk össze, 15 percig kevertettük és 5 perc állás után gázkromatográfiásán meganalizáltuk a glükóz, ramnóz stb. tartalom meghatározása céljából. Az elválasztó kolonna hőmérséklete )79°C volt. Az uronsavat, stb. karbazol-kénsavas módszerrel [módosított Bitter-Muir módszer, Bitter, T., Muir, IL : Anal. Biochem. 4, 330 (1962)] határoztuk meg. A TRS poliszacharid cukorösszetétele a következő volt: glükóz 70,3% ramnóz 13,7% uronsav 16,0%. 5) Sav-bázis sajátságok A TRS poliszacharid 0,1 és 0,5%-os oldatának pH-ja 6,70 volt. 6) ÍR abszorpciós spektrum A TRS poliszacharid ÍR abszorpciós spektrumát JASCO A-302 típusú (Japan Spectroscopic Co., Ltd.) IR spektrofotométerrel mértük meg. Az IR spektrumot az 1. ábra szemlélteti, melyen az abszcissza a hullámot, az ordináta a transzmissziót jelenti %-ban kifejezve. 7) Elemanalízis Az elemanalízist Perkin-Elmer 240 B típusú elemanalizátorral végeztük. A CjiH64038 képlet alapján végzett elemanalízis eredménye a következő volt: C = 37,2%, H = 6,4%, 0 = 56,4%. 8) Olvadáspont A TRS poliszacharid olvadáspontja 235—241°C volt, melyet Yanaco MP-3 (Yanagimoto Seisakusho, japán) olvadáspont mérő műszerrel mértünk meg. 9) Fiziológiai tulajdonságok A TRS poliszacharid emlősállatok vérének trigliceridszintjére csökkentő hatással van orális adagolás esetén. Ez az aktivitás 80—115°C hőmérséklet — és 4,1- 11 közötti pH-tartományban stabil a TRS poliszacharid tárolása esetén. A TRS poliszacharid farmakológiai tulajdonságai 1) Farmakológiai hatások Mint azt az alábbi példák mutatják, a találmány szerinti TRS poliszacharidból felépülő atherosclerózis ellenes gyógyszer különlegesen hatékonyan csökkenti emlősöjt vértriglicerid-szintjét. Ennek megfelelően ez a gyógyszer az atherosclerosishoz, hiperlipidémiához, hiperlipoproteinémiához, xantomatozíshoz, kolecistolitiazishoz, magas vérnyomáshoz, cukorbetegséghez és egyéb betegségekhez kapcsolódó betegségek terápiás vagy preventív gyógyszereként használható. A találmány szerinti készítményt emlősökbe 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 orálisan, intraperitoneálísan, intravénásán vagy egyéb módokon juttathatjuk. Alkalmanként 1 /ug 0,5 g gyógyszert adhatunk testkilogrammonként. Orális kezelés esetén 0,1 mg—100 mg/testsúly kg anyag adása előnyös. A találmány szerinti anyagot bármilyen formában használhatjuk, például fiziológiás sóoldatban vagy egyéb folyadékokban oldva, injekcióként, liofilizált porként, kúpként, külső bevonattal ellátott tablettaként, szublinguális tablettaként, granulátumként, tablettaként, kapszulaként stb. megfelelő vívőanyagokkal, hígító bázisokkal, oldószerekkel stb. együtt. 2) Akut toxicitás Mint azt az alábbi példák mutatják, a találmány szerinti TRS poliszacharid LD50 értéke nagyobb, mint 1200 mg/testúly kg intraperitoneálísan adagolva egerek esetén. Az anyag lényegében nem toxikus orális kezelés esetén. A találmányt az alábbi példákkal illusztráljuk, anélkül, hogy találmányunkat a példákra korlátoznánk. 1. példa A TRS poliszacharid előállítása és tisztítása Streptococcus faecium (FERM BP-196) törzset 2 I Rogosa tápközegre oldottuk úgy, hogy a mikroorganizmus végső koncentrációja 1 x 10” baktérium sejt/ml volt. A beoltott közeget 37°C-on 10 órán keresztül keverés nélkül aerob körülmények között inkubáltuk, így 109 baktérium sejt/ml koncentrációjú tápközeget kaptunk. A baktérium sejteket 12 000 fordulat/perc sebességű folyamatos centrifugálással gyűjtöttük össze, fiziológiás sóoldattal (0,85 s% nátrum-klorid) mostuk, és fiziológiás sóoldatban szuszpcndáltuk. így 100 ml, 2 x 1010 baktérium sejt/ml koncentrációjú szuszpenziót nyertünk. A fenti baktérium sejt szuszpenziót 115°C-on 10 percen keresztül hőkezeltük, és a zsírok eltávolítása céljából háromszor mostuk kloroform-metanol 2 : 1 térfogatarányú elegyével. A zsírtalanított baktérium szuszpenziót 3000 fordulat/perc sebességgel 10 percen keresztül centrifugáztuk, és az alsó, vagyis a kloroformos fázist félretettük. A vizes fázist használtuk a következő tisztítási lépések kiindulási anyagaként. A kiindulási anyagot ezután 100 ml foszfát-pufferban (pH = 7,8) oldott 20 mg pronázzal (XIV. típusú szigma proteáz), [mely oldat 0,0015 mól kalcium-kloridot is tartalmazott], kezeltük 47°C-on 24 órán keresztül, majd 10 mg további pronázzal kezeltük ugyanilyen körülmények között. A pronázcs kezelés kísérleti körülményeit a Methods in Enzymology (1966) VIII. kötetének 26. oldala írja le. A pronázzal kezelt anyagot két fázisra választottuk szét 3000 fordulat/percen való 10 perces centrifugálással. A felülúszó frakcióhoz 1/9 térfogatrész 100 s/tf. %*os triklór-ecetsavat (TCA) adtunk, 3 órán keresztül 4 °C-on kevertettük és 3000 fordulat/ perc sebességgel 10 percen keresztül centrifugáztuk. így két fázist, egy felülúszó és egy csapadék frakciót kaptunk. A csapadék frakcióhoz vele megegyező térfogatú 10%*os TCA-t adtunk, és megismételtük az előző eljárást. A kapott csapadékot háromszor etil-éterrel mostuk, hogy eltávolítsuk a triklórecetsavat, 50 ml desztillált vízben mostuk, 1 n nát-4
