191697. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új, a vér triglicerid-szintjet csökkentő poliszacharid és az ezt tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 2 folyósodása Növekedés 6,5%. NaCl-t tartalmazó táptalajon ♦ 40% epét tartalmazó táptalajon a + ♦ növekedés * Ammónia + + — + + fejlesztés * Hippursav ND*2 — ± — hidrolízis - Növekedés telluritot tartalmazó ± közegben Növekedés TTC-t* tartalma+ ND ND zó táptalajon Savképzés szcnforrásból ND ND Glükóz * + t + * + ♦ liszkulin ±-* + ♦ t ND ♦ inulin♦± Laktóz -• + + ± 4-± Glicerin -±Arabinóz »+_ Meleeitóz ± ND ND Szorbit Antigén * — — — csoport D D ÓID/ *1: 2.3,5-trifenil-tetrazólium-klorid K D D & *2: Nem végeztük el. 3) Tenyésztési eljárások A találmány szerinti mikroorganizmusok tenyésztése szokványos módszerrel történik. Például a baktérium sejtek Rogosa tápközegben való folyamatos aerob tenyésztéssel gyütjhetők össze és a tápközeg centrifugálásával nyerhetők ki. A Rogosa táptalaj összetétele a következő: Triptikáz (BBL Microbiology system USA) 10g Élesztő extraktum 5 g Trintóz (Oifco, USA) 3 g Kálium-hidrogénfoszfát 3 g Kálium-dihidrogénfoszfát 3 g Triammónium-citrát 2g Tween 80 1 g Glükóz 20 g Cisztein-hidroklorid 0,2 g Sóoldat *1 5 ml Desztillált víz 1 literre kiegészítve (pH 7, sterilizálás 121°C-on 15 percig) MgS04.7 H20 11,5g FeS04 :2 H20 2,4 g MnS04.2 H20 2,4 g desztillált víz 100 ml A TRS poliszacharid előállítása A találmány szerinti TRS poliszacharid egyik tipikus előállítási lehetősége a következő: 1) A mikroorganizmusok összegyűjtése A fentemlített mikroorganizmus törzsek mindegyikét Rogosa tápközegbe oltottuk, 37°C-on inkubáltuk 5 10 órán keresztül keverés nélkül aerob körülmények között, így egy olyan tápközeget kaptunk, amelynek adott életképes baktériumscjt koncentrációja volt. A fermentlevet folyamatosan kicentrifugáztuk 1 2 00 fordulat/perc sebességgel. Az összegyűjtött baktcriumsejteket sóoldattal (0,85% NaCl tartalom) mostuk 2 3 alkalommal. 2) A baktérium sejtek szétválasztása a) A mosott sejteket fiziológiás sóoldatban mostuk, és szétválasztás céljából 115°C-on 10 percen keresztül hőkezeltük. b) A baktérium sejteket mostuk, fiziológiás sóoldatban szuszpendáltuk és szonikusan (15KC, 60 perc), francia préssel és más szokványos módszerekkel szétroncsoltuk. 3) A zsír eltávolítása a sejtekből A szétválasztott sejtszuszpenziót kloroform-metanol 2 : 1 térfogatú elegyével kevertük össze. A szerves oldószerrel kiextrahálható komponenseket teljesen eltávolítottuk 3000 fordulat/perc sebességű 10 percen keresztül való centrifugálással, majd a kloroformos fázist eldobtuk. 4) Proteolitikus enzimekkel való kezelés A zsírtalanított mintát olyan proteolitikus enzimekkel, mint a pronáz, tripszin és pepszin kezeltük szokványos eljárásokkal. Ezek közül a proteolitikus enzimek közül a pronáz a legalkalmasabb erre a célra. A kezelés körülményeinek leírását a Methods in Enzymology, Vili., kötet, 26 old. (1966) tartalmazza. 5) Tisztítás A proteolitikus reakciókeverék felülúszó részéhez olyan kicsapószereket, mint a triklór-ecetsav vagy ammónium-szulfát adtunk, hogy kicsapjuk a proteinfrakciót. A fehérje-frakciót ezután a megfelelő nukleázokkal kezeltük, hogy eltávolítsuk az olyan nukleinsav alkotórészeket, mint a DNS, RNS, vagy a fehérjéket a frakcióból. Az. enzimes kezelések után az oldatot többször dializáltuk. A részlegesen tisztított fehérje-frakciót ezután további tisztítási eljárásoknak vetettük alá, mint például gélszűrés és oszlopkromatografálás , Így végül egy tiszta polisz,acharid-frakciót, amelyet TRS-nek neveztünk el, kaptunk. A TRS poliszacharid általánosságban a fiziko-kémiai tulajdonságainak megfelelően, igen sok izolációs és tisztítási eljárással állítható elő, például kicsapás-kioldas és extrakció, oldószer, extrakció, dialízis, oszlopkromatográfia, elektroforézis, gészűrés vagy ezek kombinációja segítségével. Ezért a találmányunkat nem korlátozzuk egyetlen specifikus módszerre sem. A találmány szerinti eljárás rokonságban van más, poliszacharidokból felépülő, Streptococcus fajhoz tartozó mikroorganizmusok segítségével előállítható hipotrigliceridémikusan aktív termékek előállításával, mivel a poliszacharid frakció hordozza a farmakológiái aktivitást. Ezt részletesen a példákban mutatjuk be. A tápközeg felülúszó részének hipotrigliceridémiás aktivitása a baktérium sejtekben lévő anyagának egyötöde. A TRS poliszacharid fizikémiai tulajdonságai A találmány szerinti TRS poliszacharid fizikokémiai és fiziológiai tulajdonságai a következők: 1) Kémiai jellemzők és oldékonysági tulajdonságok Az elporított minta, amelyet kisózás és fagyasztva szárítás után kaptunk, nem folyósodó fehér por volt, amely vízben igen jól, (~100 mg/ml) etanolban, metanolban és acetonban részletesen, míg éterben és kloroformban nem oldódott. 2) Mólsúly A találmány szerinti TRS poliszacharid mólsúlyát 14 000 ± 3000-re becsültük több, különböző mólsúlyú dextránt használva, gélszűrés alapján Toyo-191.697 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3
