191647. lajstromszámú szabadalom • Eljárás vinka alkaloid immunoglobulin konjugátumok előállítására
7 191 647 8 antigén/oldathoz adagolunk, amelyet 0,34 mólos borát pufferral (pH 8,6) készítettünk. A kapott keveréket ezután szobahőmérsékleten 4 órán át keverjük, és a terméket gélszűréssel elválasztjuk (1,5x26 cm-es (45,9 ml) oszlop, töltet: foszfáttal pufferolt sóoldattal kiegyensúlyozott Bio-Cel P-6). A kapott frakciókat összegyűjtjük (12,31 ml) és 270 és 280 nm-en mérve meghatározzuk a protein és vindesin tartalmat. A vizsgálat eredménye szerint a konjugátum 9,1 mól vindezint tartalmaz 1 mól Ig-re számolva. 6. példa Vindezin-szukcinoil-egér-monoklon anti-carcinoembrionális antigén konjugátum előállítása 22 mg/ml töménységű 4-szukcinoil-vindezin-N-hidroxi-szukrinimid-észter oldatot készítünk vízmentes DMF-dal (a 3. példánál leírtak szerint) majd ebből az oldatból 1 ml-t gyors keverés közben 7,0 ml 21,4 mg/ml töménységű 0,34 mólos borát puffer oldattal készült (pH 8,6) egér-monoklon-anti-carcinoembrionális antigén (Corvalan J.R.F. és mtársai, Protides of Biol.Fluids 31, 1983, 921—924) oldathoz adagoljuk. A kapott keveréket ezután szobahőmérsékleten 4 órán át keverjük, majd 3,5 ml 0,7 mólos nátrium-klorid/0,05 mólos foszfát puffer (pH 7,4) eleggyel hígítjuk, és a kapott terméket gélszűréssel elválasztjuk (3,2 x 24,4 cm-es, 196 ml-es oszlopon, töltet: foszfáttal pufferolt sóoldattal kiegyensúlyozott Bio-Gel P—6). A kapott frakciókat összegyűjtjük (28,24 ml) és 270 és 280 nm-en mérve meghatározzuk a protein és vindesin tartalmat. A vizsgálat eredménye szerint a konjugátum 5,8 mól vindezint tartalmaz 1 mól Igre számolva. 7. példa Dezacenl-vinblasztin-szukcinoil-nyúl-anti-egér Jg konjugátum előállítása 18 mg 4-szukcinoil-dezacetil-vinblastint 0,4 ml vízmentes DMF-ban oldunk, majd keverés közben hozzáadunk 0,3 ml 14,4 mg/ml töménységű, vízmentes DMF- dal készült 1,3-diciklohexil-karbo-diimid oldatot, és a keveréket szobahőmérsékleten 18 órán át, sötétben tartjuk. A kapott termék 18 mg/ml töménységű 4-szukcin-oil-dezacetil-vinblasztin N-hidroxi-szukcín-imid-észter oldat. A fenti oldatból 200 ^ul-t gyors keverés közben 1,8 ml, 8,02 mg/ml töménységű nyúl-anti-egér lg (előállítását 1. a 3. példában) oldathoz adunk, amelyet 0,34 mólos 8,6 pH-jú borát pufferral készítettünk. A kapott keveréket ezután 3,5 órán át keverjük, centrifugáljuk és a felülúszóból gélszűréssel a terméket elválasztjuk (1,5x25 cmes, 44 ml-es oszlop, töltet: foszfáttal pufferolt sóoldattal kiegyensúlyozott Bio-Gel P-6). A frakciókat összegyűjtjük és 270 és 280 nm-en mérve meghatározzuk a protein és dezacetil-vinblasztín tartalmat. A vizsgálat eredménye szerint a konjugátum 9,0 mól dezacetil-vinblasztint tartalmaz 1 mól Ig-re számolva. 8. példa Dezacetil-vinkrisztin-szukcinoil-egér-monoklon anti-melanoma antigén konjugátum előállítása 10 mg szukcinoil-dczacetil-vinkrisztint 0,1 ml vízmentes DMF-ban oldunk, majd keverés közben hozzáadunk 0,2 ml 6,5 mg/ml töménységű, vízmentes DMF-dal készült I -ciklohcxil-3-(2-morfolino-etil)-karbo-diimid meto-p-toluolszulfonát oldatot, és a kapott keveréket szobahőmérsékleten 65 órán át sötétben tartjuk. A kapott termék 20 mg/ml töménységű 4-szukcinoil-dezacetilvinbrisztin-N-hidroxi-szukcinimid-észter oldat. A fenti oldatból 200 yul-t gyors keverés közben 1.0 ml 22.7 mg/ml töménységű, 0.34 mólos borát pufferral (8,6 pH) készült egér-monoklon-anti-melanoma antigén (előállítása az, 5. példa szerint) oldathoz adjuk, és a keveréket szobahőmérsékleten 4 órán át keverjük, majd a kapott terméket gélszűréssel elválasztjuk (1,2 x 24,5 cm-es (197 ml) oszlop, töltet: foszfáttal pufferolt sóoldattal kiegyensúlyozott Bio-Gel P-6). A frakciókat összegyűjt)ük (14.16 ml) és 270 nm-en és 280 nm-en való méréssel meghatározzuk a protein és dezacetil-vinkrisztin tartalmat. A vizsgálat eredménye szerint a konjugátum 14,3 mól dezacetil-vinkrisztint taitalmaz 1 mól lg-re számolva. 9. példa Dczacetil-vinblasztin-szukcinoil-egér-monoklon aivi-tiidö-adenocarcinoma konjugátum előállítása 350 jul 14,7 mg/ml töménységű, vízmentes DMF- dal készült 4-szukcinoil-dezacetil-vinblasztin N-hidroxi-szukcinimid-észter oldatot gyors keverés közben 2,C ml, 20,0 mg/ml töménységű, 0,34 mólos borát pufferral (,6 pH) készült egér-monoklon anti-tüdő kis sejí (small cell) carcinoma antitest (Varhi és mtársai, Cancer Research, 31, 1983, 921—924) oldathoz adjuk, majd a keveréket szobahőmérsékleten 4 órán át keverjük. Ezután a reakciókeverék pH-ját 1 n HCl-val 7,4-es értekre állítjuk be, és centrifugálással tisztítjuk. A terméket gélszűréssel választjuk el (2 x 22 cm-es oszlop, 67 ml, töltet: foszfáttal pufferolt sóoldattal kiegyensúlyozott Bio-Gel P-6). A frakciókat összegyűjtjük (9,7 ml) és 270 és 280 nm-en való méréssel meghatározzuk a protein és dezacetil-vinblasztin tartalmat. Az elvégzett vizsgálat eredménye szerint a kapott konjugátum 7.5 mól dezacetil-vinblasztint tartalmaz 1 mól Ig-re számolva. A fentiekhez hasonlóan eljárva, a megfelelő N-hidroxi-szukcinimid-észtert alkalmazva, a következő konjugátumokat állítottuk még elő: vindezin-szukcinoil-egér monoidon anti-carcinoembrionális antigén-konjugátum; vindezin-szukcinoil-egér- monoklon anti-tüdő-adeno carcinoma konjugátum; dezscetil-vinblasztin-glutaroil-egér-monoklon anti-carbino-embrionális antigén konjugátum; 4 -epideoxi dezacetil-vinblasztin-szukcinoil-egér monoidon antí-carcinoembrionális antigén konjugátum. 11. példa Vindezin-szukcionil-Fab-egér monoklon-anticarcinoembnonális antigén konjugátum előállítása 2,0 ml -0,34 mólos borát pufferrel (pH 8,6) készült 20.0 mg/ml koncentrációjú egér monoklon-anticarcinoembrionális antigén oldatot (Handbook of Experimental Immunology, 3. kiadás, D.M. Weir szerk., 1978. Blackwell kiadás) gyors keverés közben elkeverünk 160 ^ul 28.5 mg/ml koncentrációjú dimetil-formamidos 4-szukcionil-vindezin-N-hidroxi-szukcinimid-észter oldattal, szobahőmérsékleten 4 órán át keverjük, majd hozzáadunk 1,0 ml foszfáttal pufferolt konyhasóoldatot és pH értékét 1 n sósavval 7,3-es értékre beállítjuk. Az oldatot centrifugáljuk és a termeket gélszűréssel (1,5 x 26 cm-es (46,0 ml) oszlop, foszfáttal pufferolt konyhasó5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
