191647. lajstromszámú szabadalom • Eljárás vinka alkaloid immunoglobulin konjugátumok előállítására
9 191 647 10 oldattal kiegyensúlyozott Bio-GeP' P-6) elválasztjuk. A frakciókat (10,6 ml) a vindezin- és fehérjetartalomra spektrofotometriásán 270 nm-en és 280 nm-en megvizsgáljuk. A termék 3,0 mól vindezint tartalmaz 1 mól Fab fragmensre számítva. 72. példa Dezacetil-vinblasztin-szukcionil-Fab-egér monoklon anti-tiidöadenocarcinoma konjugátum előállítása A konjugátumot az előző, 11. példában leírtak szerint állítjuk elő 4-szukcionil-dezacetil-vinblasztin-N-hidroxi-szukcinimid-észterből és egér-monoklón anti-tüdő adenocarcinoma Fab fragmensből kiindulva. A termék 3,9 mól dezacetil-vinblasztint tartalmaz 1 mól fragmensre számolva. Az előző példák szerint előállított konjugátumok vizsgálatára spektroszkópiai eljárást alkalmaztunk, azaz meghatároztuk 270 és 280 nm-en az abszorpciójukat (abszorpciós maximumhoz tartozó hullámhossz értékek a drog-, ill. az lg részre). A kapott értékeket és az immunoglobulin koncentrációkat a következő táblázatban foglaljuk össze. 7. táblázat 2. táblázat Konjugált drog neve Konjugált drog koncentrációja jUglnú Sejtnövekedés mértéke a sóoldattal kezelt kontroll sejtek 7r-ában kifejezve Vindezin 50 16,0 5,0 61,8 0,5 84,2 Dezacetil-50 21,5 vinkrisztin 5,0 74,5 0,5 100,0 3. táblázat Konjugált drog Sejtnövekedés mértéke a koncentrációja sóoldattal kezelt kontroll jUg/ml sejtek %-ában kifejezve 120 3,2 60 39,9 30 89,9 15 104,8 Példa száma Koncentráció mg/1 Abszorpciós maximum 270 nm 280 nm 4. 1,31 2,80 2,99 5. 0,58 1,319 1,376 6. 0,97 2,244 2,334 7. 0,369 0,707 0,786 8. 0,91 1,909 2,034 9. 0,108 0,236 0,256 10. 0,261 0,510 0,541 11. 3,57 8,61 8,90 12. 3,81 9,22 9,63 13. példa 105 mennyiségű, táptalajon tenyésztett sejtet tartalmazó készítményt teszünk egy centrifugálócsőbe, centrifugálással betöményítjük, majd mindegyikhez különböző töménységű konjugátumkészítmény 0,2 ml alikvot részét adagoljuk. Ezután a sejteket reszuszpendáljuk, 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk, majd ismét centrifugáljuk és a felülúszót elválasztjuk. A sejteket ezután szövettenyészetben szuszpendáljuk, majd tenyészet-tálkákba helyezzük úgy, hogy mindegyikben 104 mennyiségű sejt legyen. 6 nap elteltével meghatároztuk a táptalaj tenyészetekben levő sejtek számát és összehasonlítottuk azon tenyészetekkel, amelyeket csak foszfáttal pufferolt sóoldattal kezeltünk. Az egyik kísérletünkben emberi melanoma sejteket kezeltünk vindezin-szukcinoil-egér-monoklon anti-melanoma antigén konjugátummal (5. példa), valamint dezacetil-vinkrisztin-szukcinoil-egér-monoklon anti-melanoma antigén konjugátummal (8. példa). Meghatároztuk a sejtek növekedését, és a kapott eredményeket a következő 2. táblázatban foglaljuk össze. Egy másik kísérletünkben emberi colorectalis carcinoma sejteket kezeltünk vindezin-szukcinoil-egér-monoklon anti-carcinoembrionális antigén konjugátummal (6. példa), és a következő 3. táblázatban összefoglalt eredményeket kaptuk. 25 14. példa Annak érdekében, hogy a találmány szerinti eljárással előállított konjugátumok tumorellenes hatását in vivo is megvizsgáljuk, athymias egerekbe szubkután emberi 30 colorectal carcinoma sejteket inplantáltunk, majd utána intraperitoneális úton injekciókkal kétszer egy héten kezeltük őket. Az egerek egy csoportját foszfáttal pufferolt sóoldattal kezeltük, egy másik csoportjukat pedig egér monoklon antitesttel (anti-carcinoembrionális antigén) 35 vagy ezek vindezin konjugátumával (6. példa szerint előállítva). Az egereknek esetenként adagolt antitest dózis 3,3 és 3,7 mg között volt. A beinjekciózott konjugátumban a vindezin mennyisége minden esetben egerenként 119 és 128 jUg között volt. 40 61 nappal a tumor inplantálás után azokat az egereket, amelyek csak sóoldatot vagy csak antitestet kaptak, megöltük és a kialakult daganatokat vizsgáltuk és mértük. A vindezin-konjugátumokkal kezelt egereket 90 nap után öltük meg, és végeztük el rajtuk a kívánt vizsgálato- 45 kát. A kísérletek eredményeit a következő 4. táblázatban foglaljuk össze. 4. táblázat 50 Kezelés Kezelt állatok Daganatok átlagsúlya módja száma (mg) ± élt. 1 Pufferolt só oldat 11 1793 + 1609 55 Antitest magában Vindezin-10 527 ± 477 antitest konjugátum 8 22 ± 19 60 ------------------------------------------------Szabadalmi igénypontok 1. Eljárás új, (I) általános képletű — a képletben lg jelentése immunoglobulin vagy immonoglobulin 65 fragmcns, 6
