191647. lajstromszámú szabadalom • Eljárás vinka alkaloid immunoglobulin konjugátumok előállítására
5 191 647 6 a kezelés után megállapítjuk az életképes sejtek számát vagy meghatározzuk a triciált uridin felvételt. A protein és drog koncentrációt az optikai sűrűség, például 270 vagy 280 nm-en mért mérésével határozzuk meg, és a kapott értékeket olyan drog és immunoglobulin oldatokhoz. hasonlítjuk, amelyek nem tartalmaznak konjugátumokat. A találmány szerinti eljárással előállított új konjugátumok hatásosak rákos megbetegedések kezelésére, és elsősorban injekció formájában alkalmazhatók. Ennek megfelelően a találmány oltalmi körébe tartozik az új konjugátumokat tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítási eljárása is. E készítményeket, amelyek az aktív hatóanyagot gyógyszerészetileg elfogadható hordozóanyagokkal elkeverve tartalmazzák, általában egységdózisok formájában állítjuk elő, amely dózisok például 0. 01.— 2 mg aktív hatóanyagot tartalmaznak (vinkadrogban kifejezve). A találmány szerinti eljárással előállított új konjugátumok, illetve az ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények széles határok közötti mennyiségben alkalmazva hatásosak felnőtt emberek kezelésére. Az adagok hetente például 1 — 10 mg/kg (vinka drogban kifejezve), általánosabban 3—9 mg/kg mennyiséget tesznek ki. Mindazonáltal ezen mennyiségektől a kezelő orvos megítélésétől függően — amelyet a beteg állapota és a kezelési mód befolyásolhat — el lehet térni. A találmány szerinti eljárást részletesebben a következő példákkal illusztráljuk. 1. példa 4-szukcinoil-dezacetil-vifiblasztin előállítása 2 g 4-dezacetil-vinblasztint piridinben oldunk, a kapott oldathoz 2 g borostyánkősav-anhidridet adagolunk, majd a reakciókeveréket 0—50 °C hőmérsékleten 5 órán át keverjük. Az illékony komponenseket ezután vákuumban való bepárlással eltávolítjuk és a maradékot metilénkloridban felvesszük. A metilén-kloridos részt 5%-os vizes nátrium-liidrogén-karbonát oldattal, majd vízzel mossuk, a szerves fázist szárítjuk, az oldószert vákuumban eltávolítjuk. A visszamaradó anyag a kívánt 4-szukcinoil-dezacetil-vinblasztin. A fentiek szerint eljárva állíthatjuk elő még a következőket is: 4-szukcinoii-vindezin, 4-szukcinoiI-dezacetil-vinkrisztin, 4-szukcinoil-4’-epideoxi-dezacetil-vinblasztin. A 4-glutaroil-dezacetil-vinblasztin előállításánál hasonlóképpen járunk el, csak a borostyánkősav-anhidrid helyett glutasav-anhidridet alkalmazunk. Bármely fenti acilező reakció során a 3-OH csoport esetlegesen bekövetkező acilezését visszafordíthatjuk nedves szilikagéllel való kezeléssel, vagy más módszer szerint a kívánt végterméket bármely 3-acil-származéktól, vagy egyéb mellékterméktől megtisztíthatjuk kromatográfiás úton, szilikagélen etil-acetát/metanol oldószerelegyet alkalmazva eluálószerként (például a 3 392 173 sz. amerikai szabadalmi leírásban közöltek szerint). 2 2. példa A ktivált 4-szukcinoil-dezacetil-vinblasztin előállítása 1 g 4-szukcinoil-vindezint elkeverünk 380 mg N-metil-morfolinnal 20 ml metilén-kloridban, majd hozzáadunk 390 mg klór-hangyasavas-izobutil-észtert. Ezután a reakciókeveréket 0 °C-on nitrogénatmos/férában 45 percig keverjük, majd hozzáadunk 795 mg N-hid-4 roxi-szukcininádet és a keveréket visszafolyatás mellett nitrogénatmoszférában további 45 percig keverjük. Ezután a kapott anyagot lehűtjük, ion mentesített vízzel mossuk és nátrium-szulfáton szárítjuk, a szárítóanyagot szűréssel elválasztjuk, a szűrletct vákuumban bepároljuk. Így nyerjük a kívánt terméket, amely 4-szukcionil-dezacetil-vinblasztin-N-híroxi-szukcinimid-észter. 3. példa Vindezin-szukcinoil-nyíd anti-egér IgG konjugátum előállítása 25 mg 4-szukcinoil-vindezint 0,4 ml vízmentes DMF- ban oldunk és keverés közben hozzáadagoljuk 11,4 mg/ml töménységű N-hidroxi-szukcinimid vízmentes DMF-dal készült oldatának 0,3 ml mennyiségéhez, majd ehhez a keverékhez még 0,3 ml 41,7 mg/ml töménységű, vízmentes DMF-dal készült l-ciklohexil-3- -(2-morfolino-etil)-karbodiimid-meto-p-toluolszulfonát oldatot adunk, és a keveréket sötétben 48 órán át szobahőmérsékleten tartjuk. Ily módon 25 mg/ml töménységű 4-szukcinoil-vindesin-N-hidroxi-szukcin-imid-észtert nyerünk. A fenti oldatból 90 yul-t gyors keverés közben 0,9 ml 10,7 mg/ml töménységű, 0,34 mólos borát-pufferral (8,6 pH) készült nyúl anti-egér IgG/oldathoz adagolunk, a reakciókeveréket szobahőmérsékleten 5,5 órán át keverjük, a kapott anyagot gélszűréssel elválasztjuk. A gélszűréshez foszfáttal pufferolt sóoldattal kiegyensúlyozott Bio-Gel P-6-tal töltött 1x27 cm-es (21 ml) oszlopot használunk. A frakciókat összegyűjtjük (4,9 ml) és spektroszkopikus úton 270 és 280 nm-en mérve meghatározzuk a protein és vindezin tartalmukat. A vizsgálat eredménye szerint a kapott konjugátum 7,9 mól vindezit tartalmaz IgG/molekulánként. 4. példa Vindezin-szukcinoil-egér-monoklon anti-osteogen carcinoma konjugátum előállítása 28 mg/ml töménységű 4-szukcinoil-vindezin-N-hidroxi-szukcinimid-észter oldatot készítünk vízmentes DMF-dal (a 3. példánál leírtak szerint), majd ebből az oldatból 300 ^ul-t gyors keverés közben 1,5 ml 19,8 mg/ml töménységű egér-monoklon anti-osteogen sarcoma oldathoz (Embleton, M.J. és mtársai, Br.J. Cancer, 43,1981, 582—587) adunk, amelyet 0,34 mólos borát pufferral (8,6 pH) készítettünk. A kapott keveréket ezután szobahőmérsékleten 4 órán át keverjük, centrifugálással tisztítjuk, és a terméket gélszűréssel elválasztjuk úgy, hogy a felülúszót 1,5x26,5 cm-es (46,8 ml), foszfáttal pufferolt sóoldattal kiegyensúlyozott Bio-Gel P-6-tal töltött oszlopon átengedjük. A frakciókat összegyűjtjük (5,52 ml), és spektroszkopikus úton 270 és 280 nm-en mérve meghatározzuk a vindezin és protein tartalmat. A vizsgálatok eredménye szerint a konjugátum 8,7 mól vindezit tartalmaz lg molekulánként. J. példa Vindezin-szukcinoil-egér-monoklon anti-melanoma antigén konjugátum előállítása 20 mg/ml töménységű 4-szukcinoil-vindezin-N-hidroxi-szukcininiid-észter oldatot készítünk vízmentes DMF-dal (a 3. példánál leírtak szerint), majd ebből az oldatból 200 ,ul-t gyors keverés közben 1.0 ml 21,2 mg/ml töménységű egér-monoklon anti-melanoma 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
