191647. lajstromszámú szabadalom • Eljárás vinka alkaloid immunoglobulin konjugátumok előállítására
(vi) anti-human melanoma antitesteket kiválasztó egér hybridomákból származó monoklon lg; (vii) human leukémiás sejtekkel reagáló antitesteket kiválasztó egcr-hybridomákból származó monoklon lg: (viii) human neuroblastoma sejtekkel reagáló antitesteket kiválasztó egér-hibridomákból származó monoklon lg; (ix) human mellrák antigénekkel reagáló antitesteket kiválasztó egér-hibridomákból származó monoklon ig; (x) human petefészekrák sejtekkel reagáló antitesteket kiválasztó egér-hibridomákból származó monoklon lg; (xi) human osteosarcoma sejtekkel reagáló antitesteket kiválasztó egér-hibridomákból származó monoklon lg; (xii) tüdőrák elleni antitesteket kiválasztó egér-hibridomákból származó monoklon lg. Mint azt már az előzőekben említettük, az új konjugátumokat előállíthatjuk immunoglobulin fragmensekből is, így például Fab, Fab vagy F(ab’)2 fragmensekből, vagy például proteolitikus enzim emésztéssel, antitestből nyert IgM monomerekből. Ezen anyagok és az előállítási eljárások jól ismertek, és előnyös proteolitikus enzimként a pepsint és a papaint említhetjük. A találmány szerinti eljárással előállított (1) általános képletű konjugátumok közül előnyösek azok, amelyek képletében R1 -COOMe — vagy -CONH2 -csoportot, R2 metil- vagy formilcsoportot, R3 hidroxil cső portot, R4 etilcsoportot és R5 hidrogénatomot jelent és különösen azok, amelyek dezacetil-vinblasztinből és vindezinből származnak. X hidrofil csoport jelentése előnyösen 1—4 szénatomos alkiléncsoport és lg jelentése előnyösen emberi vagy állati tumor antigének elleni monoklon antitestek. A találmány szerinti eljárással az új konjugátumokat úgy állítjuk elő, hogy az immunoglobulint vagy immunoglobulin fragmenset egy olyan hemi-savszármazékkal reagáltatjuk, amely 4-es helyzetben -OCOXCOZ csoporttal — a képletben X jelentése 1—4 szénatomos alkiléncsoport és Z jelentése iehasadó csoport — szubsztituált vinka-részt tartalmaz. Pontosabban, a találmány szerinti eljárásnál egy immunoglobulint vagy egy immunoglobulin fragmenst (II) általános képletű vegyülettel — a képletben X, R1, R2, R3, R4 és R5 jelentése az (I) általános képletű vegyidet — megadottakkal azonos és Z jelentése lehasadó csoport — reagáltatunk. A (II) általános képletben Z lehasadó csoport jelentése a peptidkémiából ismert bármely csoport lehet, mely alkalmas kovalens amid-kötés (-CONH-) létesítésére a konjugátum és az immunoglobulin molekula vagy a fragmens szabad aminocsoportja között. Ezek a csoportok a szakterületen ismertek és részletesen le vannak írva a következő irodalmi helyen; Peptide Synthesis, Modanszky, Y.S. Klausner és M.A. Ondetti; 2. kiadás (1979) John Wiley és fiai, 85—136 oldalak. Megemlítjük azért, hogy Z jelentése lehet például azidcsoport (-N3), halogénatom, például bróm- vagy különösen klóratom, R7C0.0 általános képletű aciloxi-csoport — amely képletben R7 jelentése aromás vagy alifás csoport — például 1—3 szénatomos alkílesoport —, alkiloxicsoport. előnyösen 1—3 szénatomos alkoxi-csoport vagy aril-oxi-csoport, metánszulfonil-oxi-, tozil-oxi-, benzol-szulfonil-oxi-, imi-3 dazolil-csoport vagy egy N-acil-hidroxil-amin-származék. például szukcinimid-oxi-, ftálimid-oxi- vagy benzotriazolil-oxi-csoport. Előnyösek azok a vegyületek, amelyekben Z jelentése N-acil-hidroxil-amin-, például N-hidroxis/ukcinimid-észter, amelyet 1 -ciklohexil-3-(2-morfolino-etil)-karbo-diimid meto-p-toluolszulfonáttal vagy 1,3-diciklohexil-karbo-diimiddel vagy pedig klór-hangyasavas-i/.o-butil-észter alkalmazásával kapott vegyes anhidrideken keresztül állítunk elő. Ha Z jelentése imidazolil-csoport, azt karbonil-diimidazolból állítjuk elő, és ha Z jelentése R7C0.0 csoport, ahol R7 jelentése 1—3 szénatomos alkilcsoport, különösen etil- vagy butilcsoport, azt l-etoxi-karbonil-2-etoxi-l,2-dihidro-kinoliu, illetve klór-hangyasavas-izo-butil-észter alkalmazásával állítjuk elő. A (II) általános képletű vegyületeket úgy állítjuk elő, hogy a megfelelő szabad savat — amelyben Z jelentése OH-csoport — alkalmas aktiváló molekulával reagáltatunk inert oldószer — például dimetil-formamid — jelenlétében —20 °C és 75 °C közötti hőmérsékleten. A szabad savvegyületet — amelyben Z jelentése OH-csoport — a következőképpen állítjuk elő: Először előállítjuk az alkalmas 4-dezacetil indol-dihidroindolt (például a 3 392 173 számú amerikai szabadalmi leírásban ismertetett eljárás szerint). Ezután a 4-dezacetiI-vegyületet (III) általános képletű karbonsavanhidriddel — a képletben X jelentése a fenti — acilezzük.Más módszer szerint egy Z^OXCOZ2 általános képletű acilező csoportot — a képletben Z1 jelentése aktiváló csoport és Z2 jelentése karboxi-védőcsoport — használunk, és a karboxi-védőcsoport eltávolítása után nyerjük a (II) általános képletű vegyületet, amelynek képletében Z jelentése OH-csoport. Az így nyert vegyületet alakítjuk át ezután a kívánt aktivált vegyületté, alkalmas aktiváló molekulával való reagáltatássál. Az immunoglobulin vagy immunoglobulin fragmens és a (II) általános képletű vegyület reagáltatását előnyösen vizes közegben, 5 °C és 25 °C közötti hőmérsékleten végezzük, így például szobahőmérsékleten 7,5 és 9,5, előnyösen 8,0 és 9,0 közötti pH értéken. A reakció során egy vagy több vinka-rész kapcsolódik kovalens kötéssel az immunoglobulin molekula szabad aminocsopo'tján, például egy lizinből származtatott aminocsoporton. A kapcsolódó gyökök száma függ egyrészt a reagensek koncentrációjától, másrészt a reakció idejétől, és számuk általában (1—3) és (14—20) molekula között var. A találmány szerinti eljárást például úgy végeztük, hogy a (II) általános képletnek megfelelő vegyületet valamely alkalmas oldószerben oldjuk, például dimetil-formamidban, majd lassan az immunoglobulin pufféról; oldatához csepegtetjük. Pufferként például 0,34 mólos 8,6 pH értékű borát puffert alkalmazhatunk. A képződött konjugátumot gélszűréssel elválasztjuk, telített ammónium-szulfátban összegyűjtjük és: például fos/.fát-pufferrel 7,4 pH-ra beállított oldattal végzett dialízissel oldatba visszük. Más módszer szerint az összegyűjtést végezhetjük hűtőszekrényben, például 4 °C hőmérsékleten, vagy kifagyasztással — például —20 °C-on — is kinyerhetjük. A konjugátumok értékelését bármely ismert módszerrel végezhetjük, így például affinitásos kromatográfival is. A kapott konjugátumok hatásosságát megbecsülhetjük, ha tumoros sejteket kezelünk velük, majd 3 191 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
