191646. lajstromszámú szabadalom • Eljárás glükózmentes hemoglobin-koncroll előállítására
191 646 i 1 A találmány tárgya eljárás glükózmentes hemoglobinkontroli előállítására. Cukorbetegek anyagcseréjének ellenőrzésére a vér és vizelet cukorszintjének meghatározása mellett a glikozilált hemoglobin meghatározása lett a klinikai gyakorlat legkifejezőbb és legmegbízhatóbb eljárása. A hemoglobin, a vörös vérsejtek színező anyaga, mintegy 5%-ban egy színezékből, a bemből, és mintegy 95 %ban egy fehéijekomponensből, a globinböl áll, melyek komplex-szerűen vannak összekapcsolva. Ismert, hogy hemoglobin oldatok oszlopkromatográfiás elválasztásánál a hemoglobin főtömege, a HbAj, inhomogén, vagyis a főfrakció előtt egy sor gyorsabban átfutó hemoglobin eluálódik, melyeket HbAj-ként jelölnek. Ez a hemoglobin frakció felbontható a HbAj , IlbAjk és HbAjc komponensekre. A kémiai szerkezetfelderítés szerint itt glikoproteinekről, vagyis az Aj hemoglobin glikolizált termékeiről van szó, melyek szénhidrátok, így fruktóz-1,6-difoszfát, glükóz-6-foszfát, és glükóz aldehidcsoportjai és végállású aminocsoportok között lejátszódó kondenzációs reakció során képződnek. Egy egyensúlyi reakció először az instabil aldimin vegyület (Schiff bázis) képződéséhez vezet, amely egy Amadori-átrendeződéssel irreverzibilisen ketoaminná alakul. A glikozilált hemoglobin (HbAj HbAj^ és HbAjc) egy nem enzimatikus reakció során keletkezik az eritrociták mintegy 120 napos élettartama alatt. Egészséges embereknél a glikozilált hemoglobin mennyisége az összhemoglobinra vonatkoztatva 3,5—7,5%. Cukorbetegnél azonban ez az érték 20% fölé is emelkedhet. A 3 964 865 US szabadalmi leírás egy liofilizált hemoglobin-standardot ismertet az összhemoglobin kolorimetriás meghatározásához, melyet „nyers hemoglobinfrakció szűrésével úgy állítanak elő, hogy közben oxigén hozzávezetésével methemoglobinná, vagyis oximethemoglobinná oxidálják. A methemoglobint a kívánt koncentráció elérése után liofilizálják, amely ebben a formában az összhemoglobin kolorimetriás meghatározásához standardként felhasználható. Hogy teljesítsék a hemoglobinsúly meghatározására vonatkozóan a National Academy of Sciences — National Research Council, USA (NRC) és a National Committee for Standardization in Haematology (ICSH) által előírt normákat, a liofilizált standardot felhasználás előtt ciánmethemoglobinná alakítják. A technika állása szerint ismert fenti standarddal azonban csak az összhemoglobin spektroszkópiai meghatározása lehetséges, az egyes hemoglobinfrakcióké, így például a HbAj-frakcióé nem, mivel a hemoglobinnak methemoglobinná történő feloxidálása során a prosztetikus csoportok, valamint a lánc töltési viszonyai megváltoznak. Ennek következtében egy ilyen standard többek között más kromatográfiás viselkedést mutat, mint a természetes vér, és így sem a hemoglobinfrakciók közvetlen meghatározásához, sem kontroll anyagként nem használható fel, például a HbAj-meghatározáshoz választott elválasztási eljárásokhoz. A glikozilált hemoglobin mennyiségének meghatározására az összhemoglobinon belül több eljárás ismert. A HbAj gliko7.ilált hemoglobin erős negatív töltése következteben ioncserés kromatográfia, nagy nyomású folyadckkromatográfia, ízofókuszálás és elektroozmózis segítségével választható el a többi hemoglobintól. A glikolizált hemoglobin meghatározásának másik módszere a glikozilált hemoglobin oxálsavban végzett hidrolízisén, és a levált hexóz 5-hidroxi-ntetilfurfurálban végzett átalakításán alapszik, amely tiobarbitursawal (TBA) reagáltatva fotometrikusan kimutatható. Az elválasztás történhet az affinitás kromatográfia segítségével is, a hemoglobinhoz kapcsolódó szénhidrátok hidroxilcsoportjai kihasználásául. A különböző meghatározási módszerek hátránya, hogy egyazon minta analízise során az alkalmazott módszertől függően különböző eredményeket kapunk. Így például függetlenül attól, hogy a glikohemoglobin összetételének kromatográfiás meghatározásához makro- vagy mikrooszlopot használunk, a kémiai TBA-módszerrel kapott HbA.-értckek csak korrekciós faktor segítségével egyenlíthető): ki. Ezen kivül a szokásos analízis eljárásoknál részben a teljes HbAj frakciót, részben a szétválasztott HbAja b gs jjbAIc ^akciót mutatják ki, így az analíziseredmények nincsenek egységesen megadva, és ezért egymással nehezen hasonlíthatók össze. Ha például a HbAja+b+c glikolizált hemoglobin részeket határozzuk meg, amely mind a konvencionális makro-oszlopkromatográfiával, mind nagy nyomású folyadékkromatográfiával kimutatható, a két eljárással kapott eredmények csak korrelálnak, de nem esnek egybe. Összefoglalva megállapítható, hogy a glikozilált hemoglobinok meghatározására szolgáló módszerek, különösen az ioncserés kromatográfia, a frakciók szétválasztása tekintetében jó eredményeket adnak, ezek azonban az eljárás függvényében nem vihetők át, és nem hasonlíthatók össze. Az egyes elválasztási eljárások belső kontrolljaként jelenleg standard kontrollokat használnak, melyek csupán egy bizonyos eljáráshoz alkalmazhatók. A klinikai rutinvizsgálatok szempontjából azonban nagy jelentősége lenne az alkalmazott elválasztási technikák, és a kapott eredmények összehasonlításának. A találmány feladata, hogy megfelelő eljárást dolgozzunk ki stabil glikozilált hemoglobinkontroll előállítására, amely lehetővé teszi, hogy a HbAj meghatározások belső és egymás közötti minőségi ellenőrzését minden eljárás vonatkozásában ugyanazzal az anyaggal elvégezhessük. A találmány tárgya tehát eljárás HbAj meghatározás elválasztási eljárásai során belső kontrollként használható glükózmentes kontrollanyag előállítására, oly módon, hogy a mosott eritrocitákat desztillált vízzel vagy megfelelő reagenssel hemolizáljuk, a hemolizátumban a hemoglobint hígított K3[Fe(CN)6] oldattal és hígított KCN oldattal ciánmethemoglobinná alakítjuk, pufferral stabilizáljuk és megfelelő oldószerrel a lipideket és sejtmaradékokat eltávolítjuk, majd a hemolizátumot sótalanítjuk és liofilizáljuk. A stabil glikozilált hemoglobinkontroll előállítására szolgáló eljárás a hemoglobin ciánmethemoglobinná történő átalakításán alapszik. A találmány szerint előállított ciánmethemoglobin hosszabb tárolási idő után is megtartja konstans extinkciós viselkedését, míg másképpen szubsztituált hemoglobinok hosszú tárolási idő után elve szítik a Hb-variánsokra specifikus extinkciós viselkedésüket, és így standard kontrollként nem alkalmazhatók. A glikozilált hemoglobinstandard előállításához különösen előnyösnek mutatkozott, ha a szabad hemoglobin és a glikozilált hemoglobin megfelelő ciánmethemoglobinná történő átalakítása előtt az eritrocitákat ahemolízis előtt ízotonikus NaCl oldattal többször mossuk, és ezután a hemolizátumot Na-foszfát-cianid pufferral sta-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
