191646. lajstromszámú szabadalom • Eljárás glükózmentes hemoglobin-koncroll előállítására
3 191 646 4 bilizáljuk, mivel így a reakciókörülmények között egyébként instabil K3[Fe(CN)6]-komplex egyrészt megtartja oxidáló hatását, másrészt nem lép nemkívánatos mellékreakciókba a globinlánccal. A maszkírozó hatású CN-ion helyett használható például SCN-ion is. A sejtmaradékok és lipiedek tiszta eltávolítása érdekénbe előnyös, ha a hemolizátumot végül CCl4-gyel kezeljük. A CCI4 helyett használható például más zsíroldó oldószer is, például toluol, amely azonban a hemoglobinnal szemben legyen inert. Ha a találmány szerinti hemoglobinkontrollt nem használjuk fel közvetlenül az előállítás után, akkor magas vákuumban fagyasztással kíméletesen liofilizáljuk, először alacsony hőmérsékleten, majd ezt követő lassú hőmérsékletemeléssel. Ez az eljárás különösen jelentős, mivel a hemoglobin fehérjekomponensét nem szabad denaturálni, hogy ne veszélyeztessük a hemoglobinkontroli hatékonyságát a HbA] meghatározás minőségi ellenőrzése során. Az ily módon előállított kontrollanyag fény kizárása mellett, hűtve legalább 8 hónapon keresztül tárolható. A TBA-módszer vonatkozásában külön ki kell emelni, hogy a találmány szerinti eljárással előállított glikohemoglobin-kontroll nem tartalmaz meg nem kötött glükózt, mivel ez már nem szükséges az egyensúly stabilizálásához, és így az előállítás és tárolás során nem képes a glikolizált hemoglobint a megfelelő hexózra és hemoglobinra hasítani. Ez megakadályozza, hogy a TBA- módszernél magasabb értékeket kapjuk az egyébként nem specifikusan sokszorozott 5-hidroxi-metil-furfurolképződés miatt. Mivel a hemoglobinkon troli oldhatóságát nem csökkenti egy kisózás, és így néhány módszer nem mutat hamis hemoglobintartalmat, a találmány szerinti sótalanítást például gélszüréssel vagy dialízissel végezzük. Vizes közeg hozzáadására a lioűlizált hemoglobinkontroli gyorsan és egyszerűen alkalmazásra kész formára hozható. A stabil, glükózmentes glikolizált hemoglobinkontroll előállítására szolgáló találmány szerinti eljárást az alábbi példa szemlélteti közelebbről. Példa 1 ml eritrocitát 20 ml izotónikus NaCl oldatban háromszor mosunk, miközben a felülúszót a centrifugálás után mindig eltávolítjuk. A hemolizishez 1 ml desztillált vizet adunk hozzá, és 2 percen keresztül állni hagyjuk.A hemoglobin ciánmethemogíobinná történő átalakításához hozzáadunk 80 pg 5%-os K3[Fe(CN')6] oldatot és 2 ml 0,5ff-os KCN oldatot, miközben 2 percen keresztül állni hagyjuk, és többször intenzíven megkeverjük. Ezután a hemolizátumot 12 ml Na-foszfát-cianid pufferral hígítjuk, mintegy pH = 6,7-nél. Ez a pH-érték a szokásos módon elérhető, ha 4,59 g NaH2P04xH20-t, 1,18 g Na2HP04-t és 0,65 g KCN-t desztillált vízzel 1 literre hígítunk. A lipidek és sejtmaradékok eltávolításához 2 ml CCl4-t adunk hozzá, és 10 percen keresztül centrifugáljuk. Ezután a szokásos módon, például gélszüréssel vagy dialízissel sótalanítjuk. Ez a reakcióelegy mintegy 24 kontrollsíandardot ad. Az eltarthatóság érdekében magas vákuumban -40 °C hőmérsékleten, majd 48 óra alatt -20°C-ra emelkedő hőmérsékleten liofilizáljuk. Az így kapott standardkontroll sötétben, hűtés közben legalább 8 hónapon keresztül tárolható. A minőségi kontrolihoz történő felhasználáshoz a kontrollstandardot 0,5 ml, illetve 0,2 ml menynyisegü, előnyösen desztillált vízzel hígítjuk. A kontrollstandaid összliemoglobintaríalma a fenti példánál 4-6 mg/0.5 ml. A pontos meghatározást a szokásos módon végezzük. A találmány szerinti eljárással előállított standardkontrol] a glikozilált hemoglobin meghatározására szolgáló bármilyen módszerhez felhasználható, a módszer sajátságainak és minőségi előírásainak figyelembevételével, így elsőízben sikerül a hemoglobin HbAj-frakciójának meghatározásához univerzálisan alkalmazható kontrollt előállítani. A glikolizált hemoglobin különböző elválasztási technikákkal végzett meghatározását a találmány szerinti hemoglobinkontrollnál végeztük azonos mennyiségekkel és 10 párhuzamos méréssel. A glikozilált hemoglobinfrakció mennyiségére kapott értékeket az összhemoglobinra vonatkoztatva relatív százalékban adjuk meg az 1. táblázatban. Mint az 1. táblázatból is látszik, a találmány szerinti hemoglobinkontroll alkalmazásával a különböző, mégis összehasonlítható elválasztási technikákkal, így a nagy nyomású folyadékkromatográfiával (HPLC), makro-oszloppal, mikro-oszloppal, és - bizonyos korrekciós tényezők figyelembevételével az oszlopos elválasztásokkal összehasonlítható — tiobarbitursav-módszerrel kapott eredmények a módszertől függő hibahatárokon belül mozognak, így a találmány szerinti hemoglobinkontroll cukorbetegek anyagcseréjének vizsgálatához alkalmazott HbAj-meghatározáshoz általánosan alkalmazható. A kapott eredmények a legújabban bevezetett affinitás kromatográfiás vizsgálatnál is a várt nagyságrenden belül vannak. 1. táblázat Meghatározási módszer HbA(a+b (%) HbAIc (%) ossz Hb %) makro-oszlop 3,8 6,9 10,7 nagy nyomású folyadék-kromatográfia 3,6 6,7 10,3 TEA 6,4 affinitás kromatográfia 11,3 mikro-oszlop 9,8 elektroozmózis 7,3 izofokuszálás 2,8 4,2 7,0 A találmány szerinti hemoglobinstandard kontrollként történő alkalmazása lehetővé teszi, hogy olyan elválasztási technikákkal, mint az izofokuszálás és az elektroozmóás, melyek a hemoglobinfrakciók elválasztásánál mutatott eltérő mechanizmusok miatt a fenti eljárásokkal nem hasonlíthatók össze, ellenőrizzük az elválasztás megfelelő elvégzését. Mint az 1. táblázatból látható, ebben az esetben mintegy 7%-kal alacsonyabb értéket kapunk, de ezek a várt határokon belül vannak, lm a más eljárásokkal elért eredményeket vesszük alapul. Ugyanezt találjuk azonos összetételű natív vér vizsgálata eseten is. Bár a teljes HbA; frakció felbontása az egyes HbA(a+f, és HbA{c frakciókra ma még nem játszik fontos szerepet a gyakorlati vizsgálatoknál, az új glikolizált- 3 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
