191609. lajstromszámú szabadalom • Javított eljárás glükóz tartalmú cukorlé izomerizálására
15 191 609 16 hidrát- és színanyag-erősség szempontjából elemeztük, majd összehasonlítottuk az izomerizálatlan szubsztrátumon végzett hasonló elemzések adataival. Az eredményeket a következő táblázatban foglaltuk össze. folyadékot félretettük. Az oldhatatlan anyagot 250 ml 0.1 % Triton X-100-zal (Sigma Chemical Co.) ismét szuszpenzióba vittük 7.0 pH mellett, majd 8 órán keresztül 45 °C hőmérsékleten inkubáltuk. E szusz-3. táblázat 70 és 97°C-on izomerizált szubsztrátum-oldatok összetétele Kezelési mód (tömeg%-ban Szénhidrát-összetétel , hamumentes szárazanyagra számítva) Színerősség Fruktóz Glükóz Pszikóz Poliszacharid (C1RFX 100) Izomerizálatlan 0 97.6 0 2.4 0.5 Izomerizáció 70 °C-on 51.3 46.4 0 2.3 0.7 Izomerizáció 97 °C-on 55.3 41.8 0.3 2.6 35.2 Az eredmények azt mutatják, hogy 55.3% fruktózkoncentrációt sikerült elérni, míg a pszikóz-tartalom 0,4 % alatt maradt. 4. példa Ez a példa olyan magas hőmérsékletű glükóz-izomerizációt mutat be, melynek során 55.8 % fruktóztartalmat értünk el, a második izomerizácíós fokozatban Arthrobacter sp. által termelt rögzített izomeráz alkalmazásával. Egy Arthrobacter citreus törzset tenyésztettünk merített aerob fermentációval az alábbi összetételű tápközegen: súly% Xilóz 1.5 BHI (agy—szív infúziós oldat) 4.2 Élesztő kivonat 0.1 Nátrium-klorid 0.2 Kazein-aminosav 0.5 Magnézium-szulfát 0.024 PH 6.9—7.2 A fermentációt aszeptikus feltételek között 30 °C hőmérsékleten 44 órán keresztül végeztük. A sejtmasszát centrifugálással különítettük el. 0.85 %-os nátríum-klorid-oldattal mostuk, majd ismét centrifugáltuk. Ily módon hetvenhat gramm összesen 10,260 IGIU aktivitású sejtmasszát kaptunk. A glükóz-izomerázt 45 grammnyi sejtmasszából úgy vontuk ki, hogy a sejteket 250 ml mennyiségű, 900 mg tyúktojás-lizozimet, valamint 250 mg szárazanyagtartalmú BTC-835 (Onyx Chemical Co.) felületaktív anyagot tartalmazó vízben szuszpendáltuk 7,0 pH- érték mellett, 45 °C-on 16 órás inkubálással. Ezt követően a szuszpenziót centrifugáltuk, és a Felülúszó penziót ugyancsak centrifugáltuk ezután, és a felülúszó folyadékot az első centrifugálás alkalmával kapottal egyesítettük. Az egyesített kivonatokat töményítettük, és ultraszűréssel tisztítottuk Amicon 401 kevert sejtekkel, YM-30 membránt alkalmazva (Amicon Corporation). A kiszűrt anyagot (retentate) két ízben 5 térfogatrész 0.2 mM kobalt(II)-klorid és 2Q 1 mM magnézium-szulfát 7.0 pH-jú oldatával diaszűrtük. Az ultraszűrés után véglegesen visszamaradt anyag 3115 IGIU-t tartalmazott. Ezt az enzimet használtuk fel DEAE-cellulózon adszorpcióval rögzített izomeráz készítéséhez, követve a 3,788,945 számú amerikai szabadalmi leírás útmutatásait. Az oldathoz ezután összesen 4,0 g Whatman DE-23-at adtunk, a pH-t 7.0 értékre állítottuk be és a szuszpenziót szobahőmérsékleten 60 percen át keverésben tartottuk. A keletkező oldhatatlan enzimet szűréssel össze-40 gyűjtöttük, majd vízzel mostuk. A mosott rögzített enzim egy részéből a szubsztrátumban való szuszpendálás, gáztaíanítás (60 °C-on 60 percen keresztül) után 1.5 X 13 cm méretű töltetet készítettünk a magas hőmérsékletű reaktorban. 45 A reaktorba kerülő szubsztrátumot lényegében az 1. példában leírt 70 °C-os izomerizációval készítettük elő (első reakciófokozat) Ez a szubsztrátum összetételére nézve a következő komponensekből állt: Összes szárazanyag (%) 42.6 Glükóz (a szárazanyag %-ában) 46.9 Fruktóz (a szárazanyag %-ában) 52.3 Poliszacharid (a szárazanyag %-ában) 0.8 Pszikóz 0.0 Nátrium-hidrogén-szulfit (mM) 50.0 Magnézium-szulfát (mM) 5.0 Kobalt(II)-klorid (mM) 0.1 pH 6.7 A szubsztrátumot 60 °C hőmérsékleten 30 percen keresztül 6 ml/perc sebességgel szivattyúztuk át a reaktoron. A reakció megindulását követően a kolonna hőfoka gyorsan 97.8 °C-ra emelkedett, a sebességet 9
