191609. lajstromszámú szabadalom • Javított eljárás glükóz tartalmú cukorlé izomerizálására
13 191 609 14 Az első 50 ml terméket elöntöttük, a többit pedig elemzés céljára félretettük. Az eredményeket — szembeállítva az izomerizálatlan glükóz oldat adataival — a 2. táblázat mutatja be. Az alacsony hőmérsékletű (70 °C) izomcrizáeió során az előzőek szerinti összetételű szubsztrátumot 3.2 ml/perc sebességgel szivattyúztuk át az alacsony hőmérsékletű reaktoron. Az oldatból ily módon ke-2. táblázat 97.4 °Chőmérsékleten izomerízált glükóz-oldatok összetétele Szénhidrát-tartalom _ Színanyag-érték Kezelési mód (tömeg%-ban a hamumentes szárazanyagra számúvá) Fruktóz Glükóz Pszikóz Poliszacharid (C1RF X100) Izomerizálatlan 0 1 97.1 0 2.8 0.6 97.4 °C-on izomerízált oldat 55.2 42.4 0.2 2.2 12.4 Az eredmények azt mutatják, hogy több, mint 55 % fruktóz koncentrációt értünk el mindössze 0.2 % pszikóz képződése mellett. Az e példában jelentkező nagyobb színanyag mennyiség annak tudható be, hogy az egész izomerizáció magas, 97.4 °C hőmérsékleten játszódott le. szemben az 1. példa kétlépcsős folyamatával, ahol a fruktóz döntő hányada az alacsony hőmérsékletű reaktorban keletkezett (70 °C-on), így viszont elkerülhettük két külön reaktor használatát. Mindenesetre, a színanyag-érték 13 alatt maradt (CIRFX100).-i 3. példa Ez a példa szárazanyagra számítva 55.3 % fruktózt tartalmazó termék készítését mutatja be, amely tisztított kukoricakeményítő hidrolizátumból és kristályos glükózból kétlépcsős izomerizációval, a második lépcsőben kereskedelmi minőségű rögzített izomeráz alkalmazásával került előállításra. Az első reakcióhoz szükséges oldható glükóz-izomerázt az 1. példában leírt módon készítettük és tisztítottuk. E készítmény fajlagos aktivitása 40,9 IGlU/mg protein volt. Az enzimből összesen 25,000 IGIU-nak megfelelő mennyiséget 10 g Whatman DE-23 típusú DEAE-cellulózon adszorpcióval rögzítettünk. Az így előállt rögzített enzimet az 1. példában leírt 2,54 cm átmérőjű kettősfalú üvegkolonnában mint alacsony hőmérsékletű (70 C) reaktorban helyeztük el, 13 cm töltetvastagsággal. A szubsztrátumot lényegében a 2. példában ismertetett eljárás szerint készítettük, és összetétele az alábbi volt: Összes szárazanyag (%) 50.2 Glükóz (a szárazanyag %-ában) 97.6 Fruktóz (a szárazanyag %-ában) 0.0 Poliszacharid (a szárazanyag %-ában) 2.4 Pszikóz 0.0 Na I1S03 (niM) 50.0 MgS04 (mM) 5.0 CoCl2 (mM) 0.1 pH 6.8 letkezett első 1000 ml róaktorterméket elöntöttük, a többit pedig a magas hőmérsékletű izomerizáció alapanyagaként összegyűjtöttük. A magas hőmérsékletű izomerizációs reakcióhoz 25 használt enzim az Enzyme Development Corporationtól származó, kereskedelmi úton hozzáférhető rögzített izomeráz volt. Ezt az enzimet (Maxazyme GI immob., batch K-12467) előbb mozsártörőben felaprítottuk, majd 0,841 mm lyukbőségű rostán átszitál- 30 tűk. Ebből a 0,180 mm lyukbőségű rostán fennmaradt részt a szubsztrátum-oldattal szuszpendáltuk, és 60 °C-on 60 percen keresztül laboratóriumi vákuum segítségével légtelenítettük. Az így gázmentesített pépet azután egy kettősfalú üvegkolonna 1.5 X 39 cm 35 méretű tölteteként alkalmaztuk. A töltet 5200 IGIU értékű volt. Az első izomerizációs reakció (70 °C) produktumaként megjelent szubsztrátumot 6.5 pH-értékűre állítottuk be, és szárazanyagra számítva 42.6%-osra 40 hígítottuk. Az így kezelt szubsztrátum-oldatot 6 ml/perc sebességgel 60 °C hőmérsékleten 30 percen keresztül adagoltuk a kolonnába. A kolonnán belül uralkodó hőmérsékletet közvetlenül a töltet fölött elhelyezeti termométerrel követtük, mely köré 0.5 cm 45 méretű üveggyöngyöket raktunk a holttér lehető legkisebbre szorítása céljából. Amikor 97.8°C-os termosztált vizet cirkuláltattunk a reaktor két fala között, a kolonna hőmérséklete gyorsan emelkedni kezdett, és miután elérte a 97 °C-ot, a szub'sztrátum áramlási sebességét 2.0 ml/percre csökkentettük. Ennél a sebességnél a szubsztrátum és a rögzített enzim közötti kontaktidő 22 perc volt, míg az oldat reaktoron belüli tartózkodásának teljes időtartama g0 mintegy 35 perc. A kolonnából távozó terméket 50 és 58 % fruktóztartaloin közötti érték leolvasására kalibrált írószerkezetes polariméterrel figyeltük, és midőn a kilépő reakcióelegy fruktóz-koncentrációja elérte a kívánt szingg tét, szedőt váltottunk, és a kapott terméket jégfürdőben azonnal iehűtöttük. A pH-t 1 M citromsavval 4.0 értékűre szabályoztuk. A kilépő terméket mindaddig gyűjtöttük, míg a fruktóz-szint 55 % alá nem esett. A 70 °C-on, valamint 97 °C-on végrehajtott reak- 65 ciók termékeként kapott izomerízált oldatokat szén-8
