191589. lajstromszámú szabadalom • Eljárás tetszőleges koncentrációjú ciánmethemoglobin referenciaanyag előállítására
1 191 589 2 A találmány tárgya új eljárás tetszőleges koncentrációjú homogén ciánmetliemoglobin referencia-anyag előállítására tetszőleges hemoglobin-tartalmú anyag felhasználásával, vagyis teljes vérből, vörösvérsejt masszából vagy szilárd hemoglobinból, egyszerű eszközökkel és technológiával. , A gyógyászaiban a vér összhemoglobin tartalma az egyik leggyakrabban mért paraméter, elsősorban az anemia és egyéb, az abnormális hemoglobin-szinttel kapcsolatos betegségek felismeréséhez és kezeléséhez fontos ismerete. A műszaki irodalomból ismeretes, hogy a különböző típusú vérscjtszámláló és elemző készülékek általában a vér összhemoglobin (HB) tartalmának meghatározására szolgáló optikai mérőcsatornát is magukba foglalnak, bizonyos esetekben pedig ezt a funkciót egy önálló célműszer, az ún. „hemoglobin fotométer” látja el. A megbízható mérési eredmények elérése érdekében mindkét esetben elengedhetetlen a HB-mérő csatornák sorozatmérések előtti hitelesítése, Erre a célra szolgái többek között az 1CSH (International Committee for Standardization in Haematology) által ajánlott és ma már világszerte elfogadott és használt ciánmethcmoglobiu (IliCN) standard oldat. Fűnek legfőbb hátránya, hogy a legtöbb íélaulomalikus és automatikus működésű vérsejtelemző készülék hitelesítésére közvetlenül nem alkalmas, tűivel ezek a készülékek olyan egységgel rendelkeznek, amely a beadott mintát automatikusan hígítja. így az ICSH által javasolt standard oldat is ugyanolyan mértékben hígítódik, mint a vérminta; ezáltal az utóbbi standard oldat az ilyen típusú készülékek kalibrálására túlságosan kis koncentrációja miatt alkalmatlanná válik. Az ICSH véleménye szerint is a ciánmetliemoglobin standard oldaton kívül más, teljes vérszerű oldattal is kalibrálni kell a műszereket a hemoglobintartalom pontos meghatározása érdekében. („Specifications for international hemoglobincyanidc reference preparation”, 1CHS Standard EP 6/3, 1977.) Az irodalomból különböző, a ciánmetliemoglobin oldat utólag történő előállításának alapanyagaként használható készítmények, illetve az ezek előállítására szolgáló eljárások is ismeretesek. Az egyik ilyen eljárás során teljes vérből mosással, ccntrifugálással, lefagyaszt ássál ( 196 °C) és felmelegítéssel (50 °C), ccnfrifugálással és sterilre szűréssel hosszú lejárati idejű vörösvérsejt hemolizátumot állítanak elő, amelyet 2-6 °C között kell tárolni. (150.543. sz. Német Demokratikus Köztársaság-beli szabadalmi leírás) Egy másik eljárás szerint savanyú vegyhatású, nyers vérhemoiizátumot szűrnek normál atmoszférában 20—24 mikronos szűrőn, ezáltal a hemoglobinban levő FeD-iont FeDI-má oxidálják, és az így kapott methemoglobin oldatot Iiofilizálják. (3.964.865 sz. Amerikai Egyesült Állainok-beli szabadalmi leírás.) Mindkét eljárás közös hátránya, hogy a kapott anyagok közvetlenül nem, csak a bennük levő hemoglobin, ill. methemoglobin ciánmethemoglobinná való átalakítása után használhatók fel hitelesítésre. A ciánmethemiglobinná való átalakítást általában a cianid-származékokat tartalmazó Drabkin-reagens segítségével végzik. A reakció csak megfelelő idő elteltével és megfelelő hőmérséklet alkalmazása esetén kvantitatív, ezért előfordul, hogy az oldatban levő hemoglobin-származéknak csak egy része alakul át ciánmethemoglobinná, ezáltal a műszert rosszul hitelesítik, ami a későbbi mérések pontosságát károsan befolyásolja. Az első eljárás további hátránya, hogy sok technológiai lépésből áll, költséges és kiterjedt műszaki-technológiai hátteret, és szabályozott, aszeptikus körülményeket igényel, a kapott termék nem homogén, és csak hűtve tárolható. A második eljárás további hátránya, hogy liofilizált állapotból újra oldatba kell vinni a methemoglobint, s az ebből 40 perces reakcióidő után kialakuló ciánmethemoglobin koncentrációja 251-szer kisebb a vér hemoglobin tartalmánál, ezáltal a műszerek többségének kalibrálásához nem elegendő töménységű. A találmány célja, hogy a Fenti hátrányokat és hiányosságokat kiküszöbölve, különböző eredetű és jellegű hemoglobin tartalmú alapanyagokból kiindulva egyszerű és kis eszközigényű technológiával kalibrálási és hitelesítési célra közvetlenül, előzetes reakció nélkül is alkalmas, tetszőleges koncentrációjú, homogén, stabil, szobahőmérsékleten is tárolható, folyékony vagy szilárd halmazállapotú ciánmethenioglobin referenciaanyag előállítását tegye lehetővé mérgező cianid vegyüiet alkalmazása nélkül. A találmány azon a felismerésen alapszik, hogy a nitrozil-pentaciano ferrât (Hl)-anion a vérben előforduló különböző hemoglobin származékokkal egymagában is két különböző, adott, éspedig a kialakítani kívánt végtermék (reakciótermék) létrejötte szempontjából kedvező sorrendben követő reakcióra képes, nevezetesen a különböző natív hemoglobin származékok methemoglobinná történő oxidálására, és ez utóbbi reakciótermék ciánmethemoglobinná (HiCN) történő átalakítására anélkül, hogy külön oxidálóanyagot (pl. nitrilet, ferricianidot) és külön cián-származékot kialakító mérgező vegyületet (pl. alkáli-cianidot, aceton-ciánhidrint) kellene használni. A találmány szerint tetszőleges koncentrációjú ciánmetliemoglobin referenciaanyagot úgy állítunk elő, hogy egy nitrozil-pcnlaciano-fernít (Hl) aniont tartalmazó vegyületet valamely hemoglobin-készítménnyel vagy annak oldatával reagáltatunk adott esetben felületaktív anyag(ok) és/vagy szerves oldószerek) és/vagy antimikrobiális szer(ek) és/vagy stabi lizáló anyag(ok) jelenlétében, majd kívánt esetben a kapott oldatot szilárd formára feldolgozzuk, A reakciót 0 -50 °C közötti hőmérsékleten hajtjuk végre. A nitrozil-pentaciano-ferrác(III)-aniont tartalmazó vegyületet az aktuális moláris összhemoglobin koncentrációnál 0,1—30-szor, előnyösen 4-6-szor nagyobb moláris koncentrációban alkalmazzuk. Az eljárásban hemoglobin-készítményként teljes vért, vörösvérsejt masszát, vörösvérsejt masszából nyert hemolizátumot, előnyösen vörösvérsejt masszából hipotóniás hemolízissel nyert hemoglobin oldatot vagy szilárd hemoglobint alkalmazhatunk. Adott esetben a reakciót pufferolt, előnyösen szer vés vagy szervetlen foszfátot, karbon!! &> szulfhidiil 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
