191589. lajstromszámú szabadalom • Eljárás tetszőleges koncentrációjú ciánmethemoglobin referenciaanyag előállítására
3 191 589 4 vegyülefet nem tartalmazó, kis íonerősségű (p<0,IO), a vörös vérsejtek hemolizísét elősegítő biológiai eredetű felületaktív anyagot, előnyösen szaponint és/vagy epesav származékot, előnyösen nátriujn-dezoxikalátot tartalmazó közegben végezzük. Adott esetben a hemolízis elősegítésére és/vagy a nem kromoproteid jellegű fehérjék (plazmafehérjék, sejtmembránok) denaturálásnra és szelektív kicsapására az irodalomból ismert szerves oldószeres (pl. toluolos vagy triklóretilénes) eljárást alkalmazzuk Adott esetben az így előállított homogén hemoglobin származék oldatához antimikrobíáiis szereket, előnyösen p-hidroxibenzoesav észtereket, aminoglükozid és/vagy béta-Iaktáin antibiotikumot, a hemoglobin származék konformáció-stabilitásának biztosítása érdekében pedig legalább egy alifás polihidroxi vegyületet, előnyösen szacharózt és/vagy laktózt adunk. Az így előállított homogén hemoglobin származék konzervált és stabilizált oldatát szükség esetén az, irodalomban leírt eljárásokkal (mcinbráits/.tírés. ccnlrifugálás) tovább tisztíthatjuk az optikailag zavaró, nemkívánatos maradék szennyező részecskék eltávolítása céljából, és az így nyert részecskementes hemoglobin oldatot szintén az irodalomban leírt vízelvonó módszerek (liofilizálás, filmbe pariás. vákuum bepárlás) valamelyikével szilárd formára hozzuk. A találmány szerinti eljárás főbb előnyei a következők: aj Technológiai szempontból: 1. Lehetővé teszi tetszőleges koncentrációjú homogén hemoglobin származék előállítását oldat formájában és szilárd formában egyaránt; 2. Kiindulási anyaga lehet vér, vörösvérsejtmassza vagy szilárd hemoglobin ; 3. Nem igényel különleges és szabályozott hőmérsékleti körülményeket; 4. Nem igényel különleges és drága berendezéseket és eszközöket; 5. Nem szükséges az aszeptikus és steril munkakörülmények és feltételek biztosítása; 6 Mérgező anyagot, pl. kálium-cianidot nem használ a reakcióhoz. h) Felhasználói szempontból: 1. Tág hőmérsékleti határok (0-30 °C) között is hónapokig tárolható és szállítható minőségromlás nélkül; 2. A vérhez hasonló (5-25 g% = 3,1-15,5 mM/L) koncentráció-tartományban is tartalmazhat hemoglobint, ezért a mérőrendszer egészének (hígító eszközök + optikai csatornák) hitelesítésére is alkalmas; 3. Fiziológiás nátrium-kloríd oldatban vagy ionmentes vízben hígítva is közvetlenül és azonnal felhasználható hitelesítésre és ily módon felhígítva is órákig stabil; 4. A HB-transzformáló reagens minősege nem befolyásolja a hitelesítés megbízhatóságát. A találmány szerinti eljárást az alábbi példában ismertetjük anélkül, hogy találmányunkat a példára kor'átoznánk. c 1. példa „A" oldat elkészítése 500 ml ionmentes vízben feloldunk 3 gramm tris-(liídroxi-metil)-amino-metánt, 1 gramm dinátrium-EDTA-t és 5 gramm 2<N-morfolino)-etánszulfonsarat, majd az oldatot 0,45 mikron pórusméretű membránon átszűrjük. „B” oldat elkészítése 3 gramm 10 millimól nátrium-nitrozil-pentacianoferrát (Hl)-dihidrátot feloldunk 30 ml ionmentes vízben, „C" vörösvérsejt massza előállítása 1200-1500 mi frissen levett vérből vagy vérkonzervbőt szobahőmérsékleten 500 ml vörösvérsejt masszát (hemoglobin tartalom: 20 millimól) állítunk elő 1 %-os nátrium-klorid oldatban való többszöri mosással és centrifugálással. A ciánmethemiglobin előállításának menete a következő: 500 ml 40-50 °C-ra melegített „A” oldathoz él'hik vibrációs keverés közben lassan hozzáadagolunk 500 ml „C” vörösvérsejt masszát, 35—40 °C-on 1 óráig keverés közben ínkubáljuk, majd hozzáadjuk a 30 ml „B” oldatot, közvetlenül utána 400 ml szobahőmérsékletű toluolt, és a fűtést kikapcsolva még 2-3 percig homogenizáljuk a kétfázisú elegyet. A keverést leállítjuk, a kapott emulziót választótölcsérbe töltjük, és szobahőmérsékleten 24—28 óráig állni hagyjuk. A homogén alsó vizes fázist óvatosan leengedjük, és annak 1 literében keverés közben feloldunk 140 gramm szacharózt, 10 gramm D-mannifot, 400 mg neomicin-szulfátot, 400 mg p-hidroxibenz.oésav-metilész.iert és 100 mg p-hidroxi-benzoésüv-pmpilés/tcil. Az anyagok teljes feloldódása után kétszer megszűrjük az oldatot (3 mikron, ill. 0,45 mikron pórusméretű membránon), majd elvégezzük az optikai paraméterek műszeres vizsgálatát (spektrumfelvétel, ill. tartalmi meghatározás ionmentes vízben és HB-rcagensben történő különböző mértékű hígítás után). Az ellenőrzött készítményt megfelelő menynyiségekben kiadagoljuk, hermetikusan lezárjuk, és hűtőszekrényben 4-8 °C-on vagy szobahőmérsékleten 15—25 °C-on fénytől védve tároljuk. A fenti módon előállított koncentrált ciánmethemoglobin oldat ionmentes vízzel 250-szeresére történő iiígítása után felvett tipikus abszorpciós spektrumát az 1. ábra mutatja. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
