191563. lajstromszámú szabadalom • Eljárás lizozim enzim előállítására
1 191 563 2 férő nagyobb molekulatömegű bázikus fehérjék ne kötődjenek a gél felületéhez ionos kötéssel. Hljárhatunk úgy, hogy a fehérjeoldatot a fentiekben meghatározott kationcserélő géllel töltött oszlopon bocsátjuk át ; ez a megoldás azonban viszonylag hosszabb időt igényel. Egy előnyösebb módszer szerint a fehérjeoldathoz hozzáadjuk a kationcserélő gélt, és a szuszpenziót legalább 1 órán át - általában 1-3 órán át - keverjük. Tapasztalataink szerint a lizozin ez alatt az idő alatt teljes egészében megkötődik a kationcserélő gélen. A lizozim megkötéséhez igen kis mennyiségű — a fehéijeoldat súlyához viszonyítva 1-5 súly% — nedves kationcserélő gél is elegendő: A lizozim enzim megkötése után a géloszlopot vagy a fehérjeoldattól elkülönített gélt híg (általában 0,2-1 súly/térfogat%-os) vizes alkálifém-halogenidoldattal (célszerűen nátrium-klorid-oldattal) a szennyező fehérjéktől mentesre mossuk, majd a gélt 4—15 sűly/térfogat%-os — célszerűen 5-10 súly/térfogat%-os — vizes alkálifém-halogenid-oldattal (célszerűen nátrium-klorid-oldattal) eluáljuk. Tapasztalataink szerint az eluáláshoz 1 térfogatrész gélre vonatkoztatva 2-5 térfogatrész vizes alkálifém-halogenid-oldat elegendő. Ezt az oldatmennyiséget előnyösen több részletben visszük fel a gélre. A kapott eluátumból önmagában ismert módon, bázis vagy savaddíciós só formájában kikristályosítjuk a lizozimot. Amennyiben a lizozimot bázis formájában kívánjuk elkülöníteni, előnyösen úgy járunk el, hogy az eluátumot pH = 9-10-re lúgosítjuk, szükség esetén oltókristályt adunk az eluátumhoz, és az elegyet keverjük. A kivált kristályokat leszűrjük. A terméket igen tiszta állapotban kapjuk. Amennyiben a lizozimot sója formájában kívánjuk elkülöníteni, az eluátumhoz a sóképzéshez szükséges savat adjuk ; egyebekben az előzőekben közöltek szerint járunk el. Kívánt esetben a találmány szerinti eljárásban felhasznált kationcserélő géit regenerálhatjuk, majd ismételten felhasználhatjuk. A gél regenerálása során az összecsomósodott gélgyöngyöket vízben szuszpendáljuk, a szuszpenzióhoz alkaláz enzimet adunk, és a szuszpenziót szobahőmérsékleten legalább 12 órán át keverjük. Az alkaláz-enzimet hidrogén-peroxiddal inaktiváljuk, majd a gélgyöngyöket leszűrjük, és ismert módon H+-formára hozzuk. Az így regenerált gélt ismét felhasználhatjuk a találmány szerinti eljárásban. A találmány szerinti eljárás főbb előnyei a következők :- A lizozim enzim egyetlen művelettel szelektíven különíthető el a tojásfehérje-oldat egyéb komponenseitől.- Az eluátumból kikristályosított lizozim igen nagy tisztaságú (aktivitása legalább 25 000 Shugar egység/mg); ilyen tiszta termék az ismert módszerek alkalmazásakor csak többszöri átkristályosítással volt előállítható.- Az eljárás egyszerű, gyors, nagy hatásfokú, és energiaigénye minimális. — A lizozim megkötéséhez igen kis mennyiségű gyanta is elegendő. — A felhasznált kationcscrélő gyanta egyszerűen regenerálható, és igen sokszor felhasználható. A találmány szerinti eljárás előnyösen illeszthető bármely komplex tojásfeldolgozó műveletsorhoz, mert a tojásfehérje-oldathoz nem juttat idegen anyagot, abból a lizozimon kívül más anyagot számottevő mértékben nem von ki, és a tojásfehérje-oldat mennyiségét is csak kismértékben csökkenti. A lizozimmentesített tojásfehérje-oldat továbbfelhasználásra alkalmas. A találmány szerinti eljárást az alábbi példákkal szemléltetjük. 1. példa a) A kationcserélő gél felületi amidálása 1000 g száraz gélnek megfelelő mennyiségű nedves, H+ formában lévő Molselect CM-25 gélhez (karboximetil-dextrángél) 7500 ml toluolt, majd 240 g diciklohexil-karbodiimidet és 100 g ctanol-amint adunk, és a szuszpenziót szobahőmérsékleten 20 órán át lassú ütemben keverjük. A gélt leszűrjük, toluollal többször átmossuk, majd desztillált vízben szuszpendáljuk, és legalább háromszor vízben flotálva ülepítjük. A gélt ezután újra szűrjük, a szűrőn 0,5 n vizes sósavoldattal háromszor átmosva ismét H+-ciklusba hozzuk, és a sósav fölöslegét desztillált vízzel kimossuk. A mosófolyadék pH-ját indikátorpapírral ellenőrizzük, és a mosást addig folytatjuk, amíg a mosófolyadék semleges nem lesz. Körülbelül 3000 ml térfogatú nedves amidált Molselect CM-25 gélt kapunk. b) Lizozim elkülönítése tojásfehérje-oldatból 100 kg tojásfehérje-oldat pH-ját 6,5-re állítjuk, majd lassú keverés közben hozzáadjuk az előzőek szerint előállított 3000 ml amidált Molselect CM-25 gélt. A szuszpenziót szobahőmérsékleten 2 órán át lassan keverjük, majd a keverést megszüntetve a gclt 2 órán át ülepedni hagyjuk. A körülbelül 92 liter térfogatú felülúszót dekantálással elkülönítjük és porlasztva szárítjuk. 12 880 g szárított tojásfehérjeport kapunk. A gélt nagyméretű üvegszűrőre visszük, leszívatjuk, majd 0,5 súly/térfogat%-os vizes nátrium-klorid-oldattal addig mossuk, amíg a mosófolyadék fehérjementes nem lesz. A mosófolyadék fehérjetartalmát 20 súly/térfogat%-os triklór-ccetsavoldattal vizsgáljuk; a fehérjementességet a csapadékképződés elmaradása jelzi. Tapasztalataink szerint a géltérfogat körülbelül négyszeresének megfelelő mennyiségű nátrium-klorid-oldat elegendő a fehérjék lemosásához. A fehérjementesre mosott gélről 5 súly/térfogat%-os vizes nátrium-klorid-oldattal oldjuk le a lizozimot. Az eluáláshoz összesen 8000 ml nátrium-klo-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
