191563. lajstromszámú szabadalom • Eljárás lizozim enzim előállítására
1 191 56? 2 rid-oidatot használunk fel; ezt az oldatmennyiséget 3-4 részletben visszük fel a gélre. A leoldást triklór-ecetsavas próbával ellenőrizzük. Az eluátumot üvegszűrőn szűrjük, a szörletet 2 n vizes nátrium-hidroxid-oldattal pH = 10,0-re lúgosítjuk, majd oltókristályt adunk hozzá, és a lizozim bázist 24 órán át kristályosítjuk. 224 g lizozim bázist kapunk, amelynek fajlagos aktivitása 26 000 Shugar egység/mg. c) Az ioncserélő gél regenerálása A használt, csomósodott gélt körülbelül kétszeres térfogatú vízben szuszpendáljuk, a szuszpenzió pH- ját 3 n vizes nátrium-hidroxid-oldattal 8,5-re állítjuk, majd a szuszpenzióban 0,1 sú!y/térfogat% alkaláz enzimet (Boc. licheniformisból származó enzim, gyártja a NOVO cég, fajlagos aktivitása: 1,5-2,0 Anson egység/g) és 0,1 térfogat/térfogat% T ween 80-at (anionos detergens) oldunk. A szuszpenziót 24 órán át szobahőmérsékleten keverjük, majd az alkaláz enzimet 0,1 térfogat% 30 %-os vizes hídrogén-peroxid-oldattal inaktiváljuk. Az elegyet 8 órán át szobahőmérsékleten állni hagyjuk, ezután a gélt üvegszűrőn leszűrjük, és 1 n vizes nátrium-hidroxid-oldattal kezelve Na+-formára hozzuk. A gélt desztillált vízzel alaposan mossuk, ezután 1 n vizes sósavoldáttal kezelve H+-formára hozzuk, és desztillált vízzel kloridmentesre mossuk. A kapott regenerált gél desztillált vizes szuszpenzióban, fertőzéstől elzárva szobahőmérsékleten tárolható. 2. példa 7 kg Sephadex CM-25 ioncserélő gélt az 1. példában leírt módszerrel amidálunk, majd desztillált vízzel alaposan mosunk. 19,8 liter így kapott redves gélt keverés közben 1000 kg 6,5 pH-értékű tojásfehérje-oldathoz adunk, és a szuszpenziót 1 órán át lassú ütemben, szobahőmérsékleten keverjük. A gélt ! órán át ülepedni hagyjuk. Ezután a körülbelül 920 liter térfogatú felülúszót dekantálással elkülönítjük és porlasztva szárítjuk. 131,2 kg tojásfehérjeport kapunk. A lizozimtartalmú gélt szűrőcentrifugán négyszer mossuk összesen 80 liter 0,5 súly/térfogat%-os vizes nátrium-klorid-oldattal. Az így fehérjementcsre mosott gélről a lizozim enzimet háromszori mosással, összesen 95 liter 7 sú!y/térfogat%-os vizes nátrium klorid-oldattal oldjuk le. A iizozimokíatot szűrjük, és a szűrletet 2 n vizes sósavoldattal pH = 4,8-ra savanyítjuk. Az elegyet 12 órán át szobahőmérsékleten tartjuk, majd 12 órán át +5 °C-on keverjük. A kivált kristályokat centrifugál ássál elkülönítjük és foszfor-pentoxid fölött szárítjuk. 3010 g lizozim-hidrokloridot kapunk, amelynek fajlagos aktivitása: 27 800 Shugar egység/mg. 3. példa Ebben a példában összehasonlítás céljából egy ismert eljárást mutatunk be. 100 kg tojásfehérjét 3 napig +4 °C-on tárolunk, majd pH-ját 1 n vizes káiium-hidroxid-oldattal 10,0- re állítjuk. Az oldat térfogatát lemérjük, és az oldatban erős keverés közben 5 súly/térfogat% szilárd nátrium-kloridot oldunk fel. Az oldathoz lizozim bázis oltókrístályt adunk, és 1 hétig szobahőmérsékleten tartva kristályosítjuk. A kristályosodást elősegíthetjük, ha az elegyet napközben szobahőmérsékleten keverjük, és éjszakán át +4 °C-on állni hagyjuk. A kivált kristályokat ccntrifugálással elkülönítjük, 10 liter hideg desztillált vízben szuszpendáljuk, és a szuszpenziót 1 n vizes ecetsav-oldattal keverés közben pH = 5,5-re savanyítjuk. A kapott oldalban 5 súly/térfogat% szilárd nátrium-kloridot oldunk, majd az elegy pH-ját 1 n vizes káliutn-hidroxidoldattal 10,0-re állítjuk. 48 óra múlva a kapott lizozim bázis* a fenti módon átkrisfályosítjuk, és ezt a műveletsort még háromszor megismételjük. A négyszer átkristályosított lizozim bázist 5 liter hideg desztillált vízben oldjuk, az oldatot 1 n vizes ecetsav-oldattal pH = 5,5-re savanyítjuk, szűrjük, és a szűrletben 5 súly/térfogat% szilárd náírium-kloridot oldunk fel. Az oldatot 4 °C-ra hű tjük, és vizes sósavoldattal pH = 4,5-re savanyítjuk. A kristályosodás 4-5 nap alatt válik teljessé. A kristályokat üvegszűrőn kiszűrjük, és etanollal egyszer, majd acetonnal háromszor mossuk, végül szobahőmérsékleten szárítjuk. 196 g lizozin-hídrokloridot kapunk, amelynek fajlagos aktivitása 22 400 Shugar egység/mg. Szabadalmi igénypontok 1. Eljárás lizozim enzim és sói előállítására tojásfehérjéből a lizozim ioncserés megkötésével, a fehérjeoldattól elválasztott ioncserélőről a lizozim ciuálásával és az eluátumban a lizozim vagy sója kristályosításával, azzal jellemezve, hogy a pl 1 — 6-8 értékűre beállított tojásfehérje-oldatot 25 000-cs átlagos kizárási molekulatömegnél kisebb pórusméretű, felületén amidáit, gyengén savas kationcserélő géllel hozzuk érintkezésbe, majd a gélt legföljebb 1 súiy/térfogat%-os vizes alkálifém-halogenid-oldattal mossuk, 4-15 súly/térfogat%-os vizes alkálifém-halogenid-oídatíai eluáljuk, az cluátumból önmagában ismert módon, szabad bázis vagy só formájában kikristályosítjuk a lizozim enzimet, és kívánt esetben az ioncserélő gélt regeneráljuk. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítás-! módja, azzal jellemezve, hogy a tojásfchérje-oldatbó! a üzozimot felületén amidáit karboximelil-dextrán vagy karboximetil-celiulóz géllel köt jük meg. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás foganatosítást módja, azzal jellemezve, hogy a tojásfehérje-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 4
