191487. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hup gént tartalmazó baktériumtörzs előállítására és nitrogénkötés fokozására
7 191 487 8 (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD, USA; 10 egység/pl) enzimmel 20- 115 perc közötti időtartamig 100 mM Tris-HCl, pH 7.2, 50 mM nátrium-klorid, 5 mM magnézium-kioríd és 2 mM ß-merkapto-etanol összetételű oldatban. Minden egyes EcoRl emésztési időpontból alikvot mintát veszünk ki és gél-elektroforézissel vizsgáljuk Meyers et al. módszerével [Meyers, J. A., Sanchez, D., Eiwell, L. D. and Falkow, S., J. Bacteriol., 127, 1529-1537 (1976)] Haisgland és Verma módosítását alkalmazva [Haugland R. A., and Verma. D. P. S., J. Mol. Ap.pl. Genet., 1, 205-207 (i981 )], hogy a körülbelül 30 kb., 22 kb. és 15 kb. méretű DNS-darabokat tartalmazó mintákat azonosítsuk. A három csoport mindegyikébe körülbelül 50pg DNS tartozik, ezeket egyesítjük, majd először azonos térfogatú fenollal extraháljuk (100 mM, pH 8.5 Tris-szel semlegesítve), utána kétszer két térfogatnyi; a fentiek szerint semlegesített fenollal rázzuk ki. A DNS-t ezután 2 térfogat etanol!al kicsapjuk, több mint 30 percig - 20 °C-on inkubáljuk, ! 5 percig Eppendorf mikrofugában centrifugálva ülepítjük, mossuk hideg 80 százalékos etanollal, a fentiek szerint újra centrifugáljuk, csökkentett nyomáson szárítjuk és végül újra oldjuk 0,7 ml 20 mM Tris-HCI, 10 mM EDTA, 50 mM nátrium-klorid, pH 8,0 összetételű oldatban (szacharóz-gradiens puffer. A mintát 10 percig 65 °C-ra melegítjük, majd szacharóz gradiensre rétegezzük és a Ditta et. al, által leírt körülményeket alkalmazva centrifugáljuk [Ditta, G., Staufield, S., Corbin, D. and Helinski, D. R., Proc. Natl. Acad., Sei. USA, 77, 7347-7351 (1980)]. A gradiens aljáról 0,7 ml-es frakciókat szedünk, majd az előzőekben leírt módon agaróz géleket troforézissel azonosítjuk a 12-30 kb. méretű DNS-t tartalmazó frakciókat. Az adott méretű DNS-t tartalmazó frakciókat egyesítjük, majd 4 °C-on dializáljuk 1/10 erősségű szacharóz-gradiens pufferrel szemben körülbelül 24 órán át néhányszor cserélve a puffert. A dializált mintát két térfogat etanollal kicsapjuk, Sorvall SS - 34 rotorban 20 percig 15 000/perc fordulatszámmal centrifugálva ülepítjük, csökkentett nyomáson szárítjuk és végül 0,4 ml DNS tároló pufferben oldjuk. A pLAFRI DNS-t a fentiekben leírt körülmények között £coRI enzimmel emésztjük, azzal a különbséggel, hogy az őcoRl-gyet 5 egység per pg DNS arányban alkalmazzuk, az elegyet 90 percig 37 °C-on inkublájuk, újra 5 egység EcoRl-gyet adunk hozzá minden mikrogram DNS-hez, ismét 37 °C-on 90 percig inkubáljuk és a reakciót a reakcióelegy 6 %-át kitevő 0,25 MEDTA hozzáadásával állítjuk 8 mM EDTA végkoncentrációt állítva be. A reakcióelegyet kétszer extraháljuk azonos térfogatú, újra desztillált fenollal, majd háromszor azonos térfogatú éterrel majd az éter nyomait nitrogén-áramban eltávolítjuk. A ligálást a következőképpen végezzük : 20 pg egyesített, részlegesen emésztett 12-30 kb. méretű R. japonicum DNS-t adunk minden pg EcoRI-gyel emésztett pLAFRI-hez, az elegyet etanollal kicsapjuk a fentiek szerint, majd a csapadékot újra feloldjuk ligáló pufferben (66 mM Tris-HCl, pH 7,6, 6,6 mM magnézium-klorid). A kapott EcoRI-gyei emésztett, pLAFRI és részlegesen emészetett R. japonicum DNS-t ezután 0,05 és 1,0 mg/ml koncentrációban Hgáijuk 700 egység/ml T4 ligázzal (Bethesda Research Laboratories), 66 mM Tris-HCl, pH 7,6, 6,6 mM magnézium-klorid, 10 mM ditiotreitol és 66 pM ATP összetételű oldatban 18 órán át 12°C~on inkubálva. C. A rekombinám DNS bejuttatása a befogadó törzsekbe \ rekombináns DNS-elegyet lambda fág fej- és far ok-komponenseit tartalmazó kivonattal csomagoljuk, és a kapott csomagolt kozmidokat E. coli HB 101 tö zsre adszorbeáljuk. Á csomagoló kivonatokat és a DNS csomagolását Blattner és munkatársai eljárásának [Blattner, F. R., Blachl, A. E., Dennis ton-Thompson, K., Faber, H. E., Richards, J. E., Slightom, J. L., Tücher, P. W., Smithies, O., Science. 202. 1279-1284 (1978)] következő módosításaival végeztük, az E. coli BHB 2688 és BHB 2690 lambda lizogén törzsek felhasználásával (lísd 1. Táblázat). Minden egyes lambda lizogént 500 ml LB táptalajban, 2 literes lombikban 32 °C-on körülbelül 3 x 108 sejt/ml sűrűségig növesztjük. A tenyészeteket vízfürdőn 45 °C-ra melegítjük, majd ezen a hőmérsékleten tartjuk 30 percig állandó keverés közben. Majd egy órára 37 °C-os rázóra tesszük, utána jegbehűtjük. Az extraktumok ezt követő minden előállítási lépését 4 °C-on végezzük. BHB 26S8 extrák tűm készítése A BHB 2688 törzs három 500 ml-es tenyészetéből származó sejteket 10 percig 9000/perc fordulatszámnal Sorvall GSA rotorban centrifugáljuk, majd az üledéket összesen 3 ml 10 % szacharózt, 50 mH Trís- HCl-t (pH 7.4) tartalmazó pufferben szuszpendáljuk. Összesen 150 pg nagyon tiszta lizozimet (Sigma) adunk hozzá 75 pl össztérfogatban, 0,25M pH 7,4 Tris-HCl-ben. A szuszpenziót óvatosan megkeverjük majd folyékony nitrogénben lefagyasztjuk. Utána jégre helyezve megolvasztjuk, 400 pl, Blattner és munkatársai által leírt Ml puffert adunk hozzá, 30-45 percig 4 °C-on inkubáljuk, majd 35 percig 28 000/perc fordulatszámmal Beckmann 30-as típusú rotorban centrifugáljuk. A BHB 2688 extraktum a felülúszó alikvotjaiból áil, — 70 °C-on tárolva. BHB 2690 extraktum készítése 500 ml BHB 2690 tenyészetből származó sejteket 10 percig 9000/perc fordulatszámmal Sorvall GSA rotorban centrifugáljuk, majd az üledéket 3,1 ml Blattner és munkatársai által leírt A puíTcrbcn szuszpendáljuk. A szuszpenziót Blattner és munkatársai módszerével ultrahanggal besugározzuk, majd 5 percig 7000/perc fordulatszámmal Sorvall SS —34 rotorban, centrifugáljuk. A BHB 2690 extraktum a felülúszó - 70 °C-on tárolt alikvotjaiból áll. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
