191487. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hup gént tartalmazó baktériumtörzs előállítására és nitrogénkötés fokozására
9 191 487 10 A DNS csomagolása és bejuttatása E.coli-ba A DNS csomagolást a következők hozzáadásával, a következő sorrendben iniciáljuk: l\s\ Blattner és munkatársai által leírt A púder, 3 pl ligáit DNS, 1 pl Blattner és munkatársai által leírt Ml puffer, 5 pl BHB 2690 extraktum és 5 pl BHB 2688 extraktum. Miután egy órán át inkubáltuk 23 "C-on, egy csepp kloroformot adunk hozzá, az elegyből sorozathígítást csinálunk és a HB 101 törzs transzdukcióját Hohn módszerével végezzük [Hohn, B, Methods in Enzymology, 68, 299 — 309 (1979)]. A tetraciklin-rezisztens transzdukánsok szelekciója 20 pg/ml tetraciklin-tartalmú lemezen nagyszámú telep kinövését eredményezi, melyek együtt génbankot képeznek. A pHUl és pHU2 izolálásához vezető génbank készítése során a transzdukánsok 7,8 x 105/pg vektor DNS gyakorisággal keletkeztek. A kapott génbank több mint 40 000 kiónt tartalmaz. A kiónok közül 24 tetszés szerint kiválasztottnak az elemzése azt mutatja, hogy 83 %-uk tartalmaz beépített DNS-t, és annak átlagos molekulasúlya 22,6 kb. A PJHnal egy revertáló R. japonicum Hup" mutáns, ATC C 39194. Ez a biológiailag tiszta tenyészet az American Type Culture Collection, Maryland, USA, állandó gyűjteményéből szerezhető meg. A klónbankból származó telepeket tömegesen konjugaltatjuk PJ 17nal-lal, a Ditta és munkatársi által leírt háromszülős párosítási rendszer Felhasználásával [Ditta, G., Stanfield, S., Corbin, D., Helsinki, D. R., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 77, 7347-7351 (1980)]. Ebben az eljárásban mind a rekombináns kozmidokat tartalmazó E. coli tenyészeteket, mind a pRK20l3 mobilizációs segítő plazmidot tartalmazó E. coli tenyészeteket a korai logaritmikus fázisig növesztjük (körülbelül 0,4 abszorpciós egység 600 nm-nél) LB táptalajban, majd centrifugálással (8000/perc, Sorvall SS-34 rotorban) besűrítjük és 0,05 térfogat YEM táptalajban szuszpendáljuk. Az R. japonicum befogadó sejteket késői logaritmikus fázisig növesztjük (körülbelül 0,5 abszorpciós egység 540 nm-nél) YEM táptalajban és hasonlóképpen besűrítjük. Ebből a három sejtszuszpenzió mindegyikéből 0,1 ml alikvotot (körülbelül 5 x IO8 R. japonicum sejt és körülbelül 5 * 107 sejt a kétféle E. coli-bó\) szélcsztünk együtt YEM agarlemezre pH 7,0-nál, a fölös folyadékot steril lamináris-boxban elpárologtatva távolítjuk el, majd a sejteket 3-4 napig 29 °C-on inkubáljuk. Ezután a sejteket leszedjük a lemezről és 8 ml, a HUM táptalajhoz használt, 0,01 % Tween 80-at tartalmazó ásványi sók oldatában szuszpendáljuk. 10“1 — 10_<5-os hígításokat készítünk, és 100 pg/ml tetraciklint és 100 pg/ml , nalidixin savat tartalmazó YEM vagy HUM táptalajra szélesztjük. A pHU DNS-t tartalmazó telepeket ezután azonosítjuk 3000 transzkonjugánst tartalmazó lemezekről. D. A pHU DNS-t tartalmazó telepek azonosítása A klónbankból DNS-t kapott, befogadó telepeket (transzkonjugánsok) steril szűtőpapír korongokra rcpiikázzuk (Whatman 541), és a korongokat a telepekkel felfelé Repaske-táptalaj lemezekre helyezzük [Repaske, R., Repaske, C., Appl. Env. Microbiol.. 32, 585- 591, (1976): Repaske, P.., Mayer, R., Appl. Env. Mickrobiol., 32. 592 - 597 (1976)]. A szűrőkön levő sejteket ezután dercpresszáljuk, 4-5 napig olyan atmoszférában inkubálva őket, mely kezdetben 5 % hidrogént, 5 % széndioxidot, körülbelül 0,7 % oxigént tartalmaz, a többi nitrogén. Az oxigén felhasználódik, úgy hogy az oxigén szintje fokozatosan 0,1 % alá csökken az inkubálás során és oxigénadagolással körülbelül 0,2 % értéken tartjuk. Abban az esetben ha sok Hup+ telep van jelen a derepressziós periódusban, a hidrogén-szint is lecsökken a gázkromatográfiás vizsgálatok szerint, és hidrogén-adagolással körülbelül 5 % értéken tartjuk. A derepresszált telepeket tartalmazó szűrőket eltávolítjuk a Reaske lemezekről és 0,8 ml, 200 mM jódecetsavat (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, USA), 200 mM malonsavat, 10 mM metilén-kéket (Nutritional Biochemical Co.), 50 mM kálium-dihidrogén-foszfátot, 2,5 mM magnézium-kloridot (pH 5,6, Kálium-hidroxiddal) tartalmazó oldatba merítjük. Körülbelül 15 perc múlva a lemezeket enyhén megdöntjüje és. a fölöslegben levő oldatot Pasteur pipettával eltávolítjuk a szűrők oldalairól. További 45 percet várunk, hogy a festék/inhibitor oldat egyensúlyba jusson a telepekkel, majd a lemezeket a szűrőkkel és a szűrőkhöz tapadt telepekkel áttesszük egy plexiüveg tálcába (belsőméretek : 29 * 39 * 3 cm), melynek külső mélyedésébe vizet töltünk. A plexiüveg tetőt, mely beleillik a külső mélyedésbe, használjuk arra a célra, hogy részlegesen megakadályozza a levegő belépését a tálcába. A fedőn található még két kivezetés, melyek lehetővé teszik a gázpalackokból bevitt gázok ellenőrzött ki- és belépését. 15 percig nitrogéngázt áramoltatunk a kamrán keresztül, hogy csökkentsük az oxigén-koncentrációt a szűrők felett. A kamrát biztonsági okok miatt elszívó fülkébe tesszük, majd hidrogén gázt (előzőleg katalitikus oxigén-tisztítón - Engelhardt Industries, Inc., bocsátjuk keresztül) vezetünk be körülbelül 150 ml/ perc áramlási sebességgel. Mindkét gázt a plexiüveg kamrába való belépés előtt vizen buborékoltatjuk keresztül, hogy csökkentsük a szűrőkről való párolgást. A hidrogén felvételére képes telepek 0.5 — 3 óra alatt a leukoformára redukálják a metilén-kéket, míg a Hup " telepek 20 vagy több óra alatt sem redukálják a metilén-kéket. A Hup“ befogadó sejtek között körülbelül 10~2-10~3-as gyakorisággal találhatók Hup+ telepek. A Hup+ telepeket azután az anyalemezről izoláljuk, és pHU kozmid DNS-t az alábbiak szerint izoláljuk. 5 10 15 20 25 :o 25 m <+5 F.O 55 6
