191487. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hup gént tartalmazó baktériumtörzs előállítására és nitrogénkötés fokozására
1 191 487 2 A találmány tárgya eljárás hup gént tartalmazó baktériumtörzs előállítására és gümős növények nitrogénkötésének fokozására. Részletesebben, a találmány tárgya a nitrogén-kötésben melléktermékként keletkező hidrogén-molekulák oxidációját elősegítő és ezáltal a nitrogén-kötési eljáráshoz felhasználható energia mennyiségét megnövelő DNS-darabot tartalmazó nitrogén-kötő mikro-organizmusok tiszta törzseinek előállítása. A gümős növények nitrogén-kötésének elősegítésére a magvakat a nitrogén-kötő mikro-organizmusok kívánt törzseivel oltjuk be. Különböző technikákat használunk, ideértve a növények növesztése helyén levő földnek a tenyészetekkel való keverését. Gyakrabban a magvakat a kívánt nitrogén-kötő mikroorganizmusokat tartalmazó közeggel borítjuk. Mikor az ilyen borítással rendelkező magvak csíráznak, a csírázó növények közvetlenül érintkeznek a mikroorganizmussal. A gümőkből, valamint az összes ismert forrásból származó nitrogenázok nemcsak N2-nek NH4-gyé, hanem protonoknak H2-vé való, ATP-függő redukcióját is katalizálják. Ez a hidrogén-termelés az organizmusnak a nitrogén-kötési folyamathoz előállított energiájának rossz hatásfokú felhasználását eredményezi. Kisszámú Rhizobium törzs kivételével a legtöbb nitrogén-kötő, szabadon élő mikroorganizmus rendelkezik a nitrogén-kötés során keletkező hidrogént oxidáló, H2-t újra hasznosító rendszer szintézisének képességével, ezáltal visszanyerve valamennyit a H2- fejlődés során megszökő energiából. [Evans, H. J., Purohit, K., Cantrell, M. A., Eisbrenner, G., Russell, S. A., Hanus, F. J., and Lepo, J. E. 1981, Current Perspectives in Nitrogen Fixation, ed. Gibson, A. H. and Newton, W. E. (EIsevier/North Holland, New York, NY), 84-96]. Dixon [Dixon, R. O. D., Biochimie, 60, 233-236 (1978)] mutatott rá a nitrogén-kötő organizmusok H2-oxidáló képességének számos potenciális előnyére. Az ezt követő vizsgálatok kimutatták, hogy az R. japonicum-ban levő aktív H2-oxidáló rendszer képes megnövelni a bakteroid sejtek ATP tartalmát és a bakteroid nitrogenáznak az oxigén inaktiválástól való további védelmére ad mechanizmust [Emerich, D. W., Ruiz Argueso, Ching, T. M. and Evans, H. J., J. Bacterial, 137, 153-160 (1979)}. Üvegházban és szántóföldi kísérletekben az R, japonicum hidrogenáz pozitív (Hup+) csoportjaival oltott szójabab növényekről azt közölték, hogy szöveteikben és magvaikban magasabb százalékban tartalmaztak nitrogént mint a hidrogenáz negatív (Hup-) csoportokkal oltott növények. [Albrecht, S. L., Maier, R. J., Hanus, F. J., Russell, S. A., Emerich, D. W., and Evans, H. J. Science 203, 1255- 1257, (1979)], [Hanus, F. J., Albrecht, S. L., Zablotowicz, R. M., Emerich, D. W., Russell, S. A., and Evans, H. J. Agron. J. 73, 368-372, (1981)]. Az R. japonicum erős H2-oxidáló tulajdonságú törzseiről kimutatták, hogy képesek kemolitotróf módon nőni, hidrogént és széndioxidot használva energia- és szén-forrásukként [Hamus, F. J., Maier, R. J., and Evans, H. J. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 76, 1788-1792 (1979)]. A hidrogént a hidrogenáz enzim oxidálja és a széndioxidot az RuBP-karboxiláz köti meg [Lepo, J. E., Hamus, F. J., és Evans, H. J., J. Bacteriol, 141, 667 - 670 (1980)]. Az ilyen kemolsitotróf tulajdonsággal rendelkező törzsek nagyobb valószínűséggel maradnak életben a talajban, ahol a kötött szén korlátozott mennyiségben fordul elő. Erősen aktív hidrogén-oxidáló rendszert az R. japonicum törzseknek csak körülbelül 25 %-ban találtak, és egyetlen R. trifoiii vagy R. metiloti törzsben sem találtak ilyet [Evans, H. J., Purohit, K., Cantrell, M. A., Eisbrenner, G., Russell, S. A , Hanus, F. J., & Lepo, J. E. (1981)] Current Perspectives in Nitrogen Fixation, eds. Gibson, A. H. & Newton, W. E., (E'sevier/North Holland, New York, NY) 84-96]. Az R. leguminosarum legtöbb törzse Hup“ és néhány kivétellel ennek a fajnak a Hup+ törzsei a nitrogenáz reakcióban keletkező hidrogénnek csak kis részét használják fel újra [Nelson, L. M. and Salminen, S. O., J. Bacteriol., 151, 989-995 (1982)]. Hasznos lenne, ha a Rhizobium számos faja közül bármelyik Hup- törzset Hup + -ra lehetne módosítani, például úgy, hogy erősen aktív Hup+ törzsekből a Hup fenotípust létrehozó géneket átvisszük a Hup- törzsekbe. A Hup fenotípus génjei átvitelének előnyös hatásai nem csak a a hidrogén felhasználásában nyilvánulnának meg, hanem a kemolitotróf növekedés képességében is. A Hup fenotípus legalább néhány determinánsáról kimutatták, hogy Alcaligenes eutrophus-ban plazmidon találhatók és átvihetők [Friedric, B., Hogrefe, C., & Schlegel, H. G. J. Bacteriol. 147, 198-205 (1981)] és R. leguminosarum-ban (Brewin, N. J., DeJong, T. M., Philips, D. A. and Johnston, A. W. B. Nature 288, 11-19 (1980)]. Mind R. leguminosarum-ban és A. eutrophus-bzn a Hup fenotípust nagyméretű, természetes plazmídok hordozzák, melyek számos más gént is kell, hogy hordozzanak. R. leguminosarum-ban a Hup determinánst hordozó plazmádról azt is kimutatták, hogy noduláció (gümőképzés) specifikus és nitrogén-kötés specifikus determinánsokat is hordoz. Ennek a plazmidnak a gazda-specifitása szűk lehet [Brewin, N. J., DeJong, T. M., Phillips, D. A, and Johuston, A. W. B., Nature, 28, 77-79 (1980)], és a plazmidot befogadó mikroorganizmusok valószínűleg csak borsó-növényeken képesek hatásos gümőket létrehozni. A hidrogén-felvételt mérő technikákat leírták [Hanus, F. J., Carter, K. R., & Evans, H. J., {Methods Enzymol. 69, 731 -739, (1980)] [Bethlenfalvay, G. J. & Phillips, D. A. Plant Physiol, 63, 816—820, (1979)]. Azotobacter chroococcum telepeket vizsgálták át a hidrogenáz aktivitás megnyilvánulása szempontjából, a Hup+ és Hup- Azotobacter telepek metilénkékredukáló képességének sebességében megnyilvánuló különbség megfigyelésével [Postgate, J. R., Partridge, C. D. P., Robson, R. L., Simpson, F. G., and Yates, M. G., J. Gen Microbiol, 128, 905-908 (1982)]. De ezen módszerek egyike sem foglalkozik Hup + Rhizobium telepeknek nagyszámú telep közül való izolálásával. A hidrogén-felvevő rendszerek genetikai információjának széles gazdaspecifitású, átvihető DNS replikonba való bejuttatására fejlesztettünk ki módszert. A hidrogenáz kifejeződés determinánsait hordozó törzsek szükségszerű izolálásához nagyszámú baktéri5 1C 1C 20 25 30 35 4 J 45 E0 65 00 05 2
