191487. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hup gént tartalmazó baktériumtörzs előállítására és nitrogénkötés fokozására
3 4 um-telep átvizsgálására találtunk módszert. Ezeknek az eljárásoknak a termékei, a pHUi és pHU2 DNS-ek hidrogén-felvevő géneket tartalmaznak a Rhizobium japonicum 122 DES törzsből, és Escherichia coli-ból a Hup" R. japonicum PJ 17-nal és PJ 18-nal mutáns törzsekbe lettek átvíve, és ezeknek a törzseknek a szabadon élő törzseit átalakították Hup+ fenotípusúra, az első esetben legnagyobb valószínűséggel geneti kai kompiementációval, a második esetben rekombi nációval. Mind a pHUl mind a pHU2 képes a szójabab giimőkben előforduló PJ 17-nal bakteroidoknak elegendő hidrogén-felvevő aktivitást adni, hogy a gumókban keletkező összes hidrogént hasznosítsák. Ezek a termékek és a leírt eljárással előállított más termékek felhasználhatók arra, hogy a hidrogénfelvevő rendszer genetikai információját bejuttassák olyan Rhizobium törzsekbe, melyekből az jelenleg hiányzik. A bejuttatott genetikai információ kifejeződése a befogadó Hup- Rhizobium törzsekben megnöveli a nitrogén-kötéshez elérhető energia mennyiségét. A találmány szerinti eljárásban rekombináns DNS technikát használunk egy szűrővizsgálati módszerrel együtt, hogy a hidrogén-felvevő fcnotípusra specifikus géneket kódoló DNS-t tartalmazó rekombináns replikonokat előállítani és izolálni tudjuk. Ezekre a replikonokra a továbbiakban mint pHU DNS-ekre hivatkozunk. Ezekre a replikonokra példa, az alábbiakban leírt pHUl és pHU2 kozmidok. Az alábbiakban következő I szakasza pHU DNS előállításának és izolálásának részletes leírása. A II szakasz az eljárással készült rekombináns kozmidok részletes leírása. A következő meghatározások hasznosak lehetnek a leírás terminológiájának megértésében. Replikon — Független replikáiddá sra képes genetikai elem. Ilyen lehet a plazmid, kozmid vagy bakteriofág DNS. Hup+ — Bármely organizmus fenotípusának jelzése, amely képes hidrogén-gáz felvételt mutatni - azonos értelmű a hidrogén-gáz oxidációjával és hidrogén felvétellel. Hup- — Bármely organizmus fenotípusának jelzése, amely nem képes hidrogén-gáz felvételt mutatni. hup — Hidrogén-felvevő gén jelzése HU DNS - hup géneket vagy a hup gének egy részét tartalmazó DNS. pHU DNS — Rekombináns DNS technikával előállított, HU DNS-t tartalmazó replikon. 1. A pHU DNS előállítása és izolálása A jelen eljárás tárgya Hup- Rhizobium törzseknek hidrogén-felvevő aktivitást adó DNS izolálása és előállítása, részletesebben a R. japonicum bizonyos speciális Hup- teszt-törzsében a hidrogén-felvevő aktivitást helyreállító DNS izolálása és előállítása. Az ilyen DNS származhat bármely olyan hup gént tartalmazó szervezetből, amelyik képes a R. japonicum Hupteszt törzseivel komplementációt mutatni vagy rekombinációt mutatni ezekkel az R. japonicum törzsekkel, így Hup+ fenotípusúvá alakítva őket. A vektor DNS, amelyhez a Hup gént tartalmazó DNS (a beépített DNS) kötődik, bármely, az R. japonicum-ba bejuttatható és ott fenntartható replikon lehet. A találmány szerinti eljárás számos lépésből áll, inagában foglalva egyet vagy többet a következőkből : A. Baktérium-törzsek tenyésztése és a DNS izolálása, B. Beépített DNS/vektor DNS rekombinánsok készítése, C. A rekc-möináns DNS bejuttatása a befogadó örzsbe, D. A pHU DNS-t tartalmazó befogadó törzsek azonosítása, E. A pHU DNS izolálása. í A D lépés különösen érdekes, mivel a Hup fenotipusú telepeknek az R. japonicum ezernyi telepétől való megkülönböztetését lehetővé tevő eljárást foglalja magában. A telepeket bármely standard tenyésztő táptalaj-lemezeken tenyésztjük, majd korongokra replikázzuk (például szűrőpapír korongokra), majd a hidrogén-felvevő rendszert dcrcprcsszáló körülmények között inkubáljuk. Megfelelő idő eltelte után a korongokat metilén-kéket és a belső légzést gátló anyagokat tartalmazó oldatba áztatjuk. A gátló anyagok koncentrációjának elégnek kell lenni, hogy a metilén-kék festéknek belső légzés útján történő redukcióját meggátolják. Ha a korongokat hidrogén-áramban inkubáljuk, csak az aktív hidrogenázzal rendelkező (Hup+) telepek adnak hidrogén-függő meti!én-kék redukciót, amit a korongon a metilénkéknek színtelen formára való redukciója bizonyít. A. Baktérium-törzsek tenyésztése és a DNS izolálásaj Az E. coli törzseket, hacsak külön nem közöljük, LB táptalajon tenyésztjük 32 'C-on [Kahn, M. et al, Methods in Enzymology, 68, 268 — 280 (1979)]. Az R. japonicum-oX általában a Vincent által leírt élesztőkivonat mannitot táptalajon, folyékony táptalajban vagy agarlemezen növesztjük [Vincent, J. M. A Manual for the Practical Study of Root-Nodula Bacteria (Blackwell, Oxford), 59 — 60 (1970)], vagy a hidrogén-felvételi táptalajon [Maier, R. J. et al. Proc. Natl. Acad Sei., USA, 75, 3258-3262 (1978)], melynek pH-ját 7,0-ra állítjuk és 0,15 g nátrium-dihidrogénfoszfát (egy kristályvízzel) helyett 0,2 g kálium-dihidrogén-foszfátot (egy kristályvizcs) és 0,03 nátriuindihidrogén-foszfát hozzáadásával módosítjuk. A használt E. coli és R. japonicum törzseket az 1. táblázatban soroljuk fel. A pLAFRl kozmidot Friedman és munkatársai készítették [Friedman, A. M. Long, S. R., Brown, S. E., Buikema, W. J., and Ausubel, F. M., Gene, 18, 289-296 (1982)] a G. Ditta, S. Straufield, D. Corbin és D. Helinski által készített pRK290 plazmidból [Proc. Nail. Acad. Sei., USA, 77, 7347-7351 (1980)] és ez egy széles gazdaspecifitású klónozó vektor. Az SR, PJ17 és PJ18 nalR származékai (I. táblázat) konvencionális technikával nyert spontán nalidixinsav-rezisztcns mutánsok. 181 48' 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3
