191397. lajstromszámú szabadalom • Eljárás biológiailag aktív anyagok előállítására hibrid sejtvonal tenyésztésével
9 191 397 10 humán daganatos makrofág sejtvonalat. A Fúzió eredményeként a 288 luk közül tízben kapunk fúziós sejteket. Ezeknek a fúziós sejteknek a tumorgátló-anyag termelését a 2. példában leírt módon vizsgáljuk. A kapott eredményeket az alábbi, 3. táblázatban mutatjuk be. A táblázatban B-l és B-2 jelentése a perifériális vér monociták és a THP-1 (TK") felhasználásával nyert fúziós sejtek telepei. 3. táblázat Sejtvonal Hígítási faktor a tenyészet felülúszójára egér L sejtek 50 %-os pusztulásánál B-l fúziós sejtvonal 8 B-2 fúziós sejtvonal 4 THP-1 (TK1 < 2 Perifériális vér monocita 2 4. példa Emberi tüdő átmosásával nyert 50 ml szuszpenzióban levő sejteket lecentrifugálva 1,0 X 107 alveoláris makrofágot kapunk. A sejtek túlélési aránya a tripán-kék kirázásos teszt alapján 93 %. 1,0 X 107 humán alveoláris makrofágot keverünk az 1. referenciapélda szerint előállított 3 X 107 U-397 (TK") sejttel, majd a keveréket RPMI-1640-ben szuszpendáljuk. A fehérjék eltávolítására a sejteket centrifugálással mossuk. Ezután a sejtek fuzionáltatását az 1. példában leírt módszerrel hajtjuk végre, 250 luk közül háromban kapunk fuzionált sejteket. A fuzionált sejtek közül 30-42 % rendelkezett 50 vagy több kromoszómával. Daganatos peritonitriszes betegből nyert 500 ml aszciteszt lecentrifugálva összegyűjtjük a sejteket, majd miután az eritrocitákat 0,14 M ammónium-kloriddal lizáltuk, a sejteket 10 % borjú-magzat szérumot tartalmazó 20 ml RPMI-1640 közegben szuszpendáljuk. Ezután az 1. példában leírt módszerrel előállítunk 8 X 106 peritonális makrofágot, műanyag tálca felszínére tapadt állapotban. A sejteket 2 X 107 U-937 (TK") sejttel keverjük, majd a fúziót az 1. példában leírt módon végrehajtva, 200 luk közül ötben kapunk fúziós sejteket. A fúziós sejtek 38-55 %-ának 50 vagy több kromoszómája van. Az U-937 (TK^) és az alveoláris makrofágok közötti sejtvonalat, valamint az U-937 (TK") és peritonális makrofágok közötti fúziós sejtvonalat a 2. példában leírt módon LPS-sel serkentjük, és vizsgáljuk a felülúszók interleukin-1-aktivitását. Ugyanakkor a 2. példa szerint előállított, perifériális vér monocita és U-937 (TK^) közötti A-l fúziós sejtvonalat hasonlóképpen serkentjük LPS-sel és vizsgáljuk a felülúszó interleukin-1 -aktivitását. Az interleukin-1-aktivitás vizsgálata egér timociták triciummal jelölt timidin felvételén alapszik. 106 fúziós sejtet inkubálunk 10 /ng LPS-t tartalmazó szérummentes RPMI-1640 közeg 1 mi ében, széndioxidos inkubátorban 24 órán át. A tenyészet felülúszóját kinyerjük és 1 ml olyan, 5 % humán szérumot tartalmazó MÉM közeghez adjuk, melyben 6 hetes, C3H/HeJ egerekből származó 5 X 106 timocita van, majd széndioxid inkubátorban inkubáljuk. 48 óra múlva 1 juCi triciummal jelölt timidint adunk hozzá, és folytatjuk az inkubálást. 72 óra elteltével meghatározzuk a tenyészel fclülúszójáuak radioaktivitását. A fenti eljárást két módon, a MÉM táptalajban levő konkanavalin A 3 jug/ml koncentrációja mellett, vagy konkanavalin nélkül hajtjuk végre. Az interleukin-1 aktivitást megvizsgáltuk humán perifériális monocitánál, alveoláris makrol'ágnál, pcritoncális makrofágnál és U-937 (TK")-núl, ugyanazt az eljárást alkalmazva. A kapott eredményeket az alábbi 4. táblázatban mutatjuk be. 1 4. táblázat Sejtvonal Triciummal jelzett timidin felvétele 5-Konkanavalin A + Konkanavalin A (cpm/SXlO8 timociták) „ - LPS Pe itonális makrofag 500 14,000 48,000 145,000 Pe iferiális vér-LPS 400 40,000 monocita +LPS 17,000 125,000 Ah eoláris-LPS 600 63,000 makrofág +LPS 25,000 200,000 U-937-LPS +LPS 400 10,000 13.000 52.000 U-c'37 (TK-) peritor ális makrofág fúziós sejt-LPS +LPS 600 21,000 55,000 220,000 A-i fúziós sejt-LPS +LPS 500 21,000 58,000 220,000 A-l fúziós sejt-LPS +LPS 500 19,000 58,000 240,000 U-Ç37 (TK-) alveoláris makrofág fűz ós sejt-LPS +LPS 600 32,000 78,000 350,000 Kontroll közeg-LPS +LPS 300 1,200 10,000 23,000 5. példa Műtét után különböző betegektől nyert 5-5 gramm máj , lép-, csecsemőmirigy- és méhlepény-szövetet Hank oldattal mossuk, ollóval apróra vágjuk, rozsdamer tes acél szitán szűrjük át, majd a sejtek összegyűjtésére, lecentrifugáljuk. A sejteket 0,14 mólos ammónium-kloriddal mossuk, majd újra mossuk RPMI-1640 oldattal. Az egyesített sejteket borjú-magzat szérummal előkezelt felületű műanyag lemezekre juttatjuk. Három óra elteltével 0,025 % tripazint és 0,005 % EDTA-t tartalmazó PBS oldatot adunk a lemezekre 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
