191397. lajstromszámú szabadalom • Eljárás biológiailag aktív anyagok előállítására hibrid sejtvonal tenyésztésével
11 191 397 12 tapadó sejtekhez. A lemezeket három percig hagyjuk állni szobahőmérsékleten, majd a tapadó sejtekei gumivégű üvegbottal eltávolítjuk, majd összegyűjtjük Ezután minden egyes sejtvonalból 1 X I07 sejtet keverünk össze 3 X 107, az 1. referenciapélda szerint előállított U-937 (TK~) sejttel. A sejteket 0,1 ml humán kollagénnel előkezeljük az 1. példában ismertetett eljárásban használt fibronektin helyeit, egyébként a fúzió végrehajtására az 1. példában ismertetett eljárást követjük. Minden egyes így nyert fúziós sejtvonal citotoxikus hatását egér L sejteken vizsgáljuk a 2. példában leírt technikát használva, az inler!cukin-l aktivitást a 4. példában leírt módszer alkalmazásával vizsgáljuk. A kapott eredményeket az alábbiakban mutatjuk az |5. táblázatban. 5. táblázat Sejtvonal Hígítást faktor az L sejtek 50 %-os pusztulásánál Triciumma! jelzett timidin felvétele -rkonkanavalin A (cpm/5*106 timoeita) Lép markofág U-937 (TK~) fúziós sejt 7 —LPS +LPS 48.000 176.000 Csecsemőmirigy makrofág U-937 (TK") fúziós sejt 5-LPS +LPS 60,000 165,000 Méhlepény makrofág U-937 (TK~) fúziós sejt 8-LPS +LPS 61,000 184,000 Máj makrofág U-937 (TK") fúziós sejt 6-LPS + LPS 68,000 176,000 Lép makrofág 5-LPS +LPS 38,000 124,000 Csecsemőmirigy makrofág 3 —LSP +LPS 56,000 172,000 Méhlepény makrofág 8-LSP +LPS 32,000 120,000 Máj makrofág 5-LPS +LPS 65,000 165,000 U-937 (TK") < 2-LPS + LPS 11,000 48,000 1. referenciapélda 20 % borjú-magzat szérumot tartalmazó 50 ml RPMI-1640 oldatban szuszpendálunk IQ7 U-937 sejtet, majd I ml RPMI-1640-ben 400 pg etíi-metánszulfonátot tartalmazó 50 ml oldatot adunk hozzá. A sejteket ezután centrifugálással összegyűjtjük, majd kétszer mossuk 100-100 ml RPMI-1640-nel. Mosás után a sejteket 100 ml, 10 % borjú-magzat szérumot tartalmazó RPMI-1640 oldatban szuszpendáljuk, majd a szuszpenziót 4 db, 24 lukas Falcon-lemezre (Becton- Dickinson, Co., USA) osztjuk szét és 5 napig széndioxidos inkubátorban tartjuk. 5 nap elteltével a köz’get 10 % borjú-magzat szérumot és 1 pg/mf 5-btóm-dezoxi-uridint tartalmazó közegre cseréljük és az i ikubálást folytatjuk a széndioxidos inkubátorban. A. közeget ezután hetenként cseréljük, az 5-bróm-dezoxi uridin koncentrációját lépésenként 2,4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 30 pg/ml-re emelve 10 % borjú-magzat szérumot tartalmazó RPMI-1640 közegben. 10 lukban találunk a 10 % borjú-magzat szérumos 30 pg/ml 5-bjóm-dezoxi-uridint tartalmazó RPMI-1640-bcn túlélő sejteket. Ezeket a sejteket 10 % borjú-magzat széiumot, 10"* mól/liter hipxantint, 10”® mól/1 aminop terhit és 1,6 X 10”5 mól/liter timidint tartalmazó RPMI-1640 közegben tenyésztjük. Ennek eredményeként két olyan sejtvonalát kapunk, melyek 15 nap alatt teljesen kipusztulnak. Ezeket a sejtvonalakat has maijuk az U-937 timidin-kináz hiányos származék sejt vonalaiként. (TAM-2, ATOC CRL 8849 szám alatt deponálva.) 2. rcfercnciapölda 50 ml, 20 % borjú-magzat szérumot tartalmazó RPMI-1640 közegben 107 THP-1 sejtet szuszpendálunk és a szuszpenziót 50 ml 400 pg/ml etil-melán-sz dfonátot tartalmazó RPMI-1640 oldatban szuszpendáljuk A keveréket 5 % széndioxidot tartalmazó atmoszférában 3 órán át inkubáljuk 37 C-on. Az idő leteltével a sejteket centrifugálással gyűjtjük össze. A mosást kétszer 100 ml RPMI-1640-nel végezzük. A mosott sejteket 100 ml 10% borjú-magzat szérumé t tartalmazó RPMÍ-1640 közegben szuszpendáljuk és \ db 24 lukas Falcon-lemezre osztjuk szét, majd az int ubálást 5 napig széndioxidos inkubátorban végezzük.. 5 nap tenyésztés utált a közeget 10% borjú-magza? szérumot és 1 pg/ml 5-bróm-dezoxi-uridínt tartalmi zó RPMI-1640 közegre cseréljük, és az inkubálást folytatjuk a széndioxidos inkubátorban. Egy hét elteltével az 5-bróm-dezoxi-uridin koncentrációját 2 pg/ /rnl-re növeljük, majd egy hetes intervallumokban a közeget olyan 10 % borjú-magzat szérumot tartalmazó RPMI-1640-re cseréljük, mely lépésenként növekvő koncentrációban 4, 8, 12, 16, 20, 25 és 3C pg/ml 5-bróm-dezoxi-uridint tartalmaz. Végezetül 13 olyan lukat találtunk, melyben a 10% borjú-magzat szérumot és 30 pg/ml 5-bróm-dezoxi-uridiut ta tnlmazó RPMI-1640 közegben éiő scjlck voltak. Ezután ezeket a sejteket 10% borjú-magzat szérumot, IC1 * *"4 mól/liter hipoxantint, 10"8 mól/liter aminopterint és 1,6 X 1075 mól/liter timidint tartalmazó R^MI-1640 közegben. Ezek a sejtvonalak 15 nap alatt teljesen elpusztulnak. Ezeket a sejtvonalakat használjuk a THP-1 timidin-kináz hiányos sejtvonalaiként. (TAM-3, ATCC CRL 8850 szám alatt deponálva.) Jóllehet a találmányt részletesen, és a benne levő speciális igénypontokra hivatkozva írtuk le, a szakét nber számára nyilvánvaló, hogy különböző változtatások, módosítások tehetők anélkül, hogy eltérnénk a szellemétől és oltalmi körétől. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
