191397. lajstromszámú szabadalom • Eljárás biológiailag aktív anyagok előállítására hibrid sejtvonal tenyésztésével
7 191 397 . 8 1. példa 50 ml humán perifériális vért 5 ml-es adagokban szétosztunk 3 ml Ficoll-Conray oldatot [Böyum. A., Scand. J. Clin. Invest., 21 Suppl. 97 (1968)] tartalmazó centrifugacsövekbe úgy, hogy réteget képezzen a Ficoll-Conray oldat tetején, majd 400 g-vel centrifugáljuk 30 percig. A közbenső réteg (perifériális vér limfocita frakció) formájában kapott frakciót összegyűjtjük és 20 ml, 10 % borjú-magzat szérumot tartalmazó RPMI-1640 közegben szuszpendátjuk. À szuszpenziót 2 db, 100 mm átmérőjű petri-csészében■ oszlatjuk el, ma|d széndioxidos inkubátorban (5 % széndioxid), 37 C-on éjszakán át inkubáljuk. A műanyag petri-csészéket úgy készítjük elő, hogy körül i belül 2 ml borjú-magzat szérumot teszünk bele, legalább nyolc órán át hagyjuk hűtőszekrényben állni, majd eltávolítjuk a borjú-magzat szérumot. A műanyag petri-csészék felületéhez tapadó sejteket úgy; nyerjük ki, hogy 2 ml 0,025 % trípszint és 0,005 % EDTA-t tartalmazó PBS oldatot (fiziológiás foszfát-' -pufferolt nátrium-klorid oldatot) adunk hozzá, az egészet három percig hagyjuk szobahőmérsékleten állni, majd a felülethez tapadt sejteket gumival borított végű üvegbottal távolítjuk el. A kapott sejtek, (sejtszám: 1,5 X 107) legnagyobb része monocita és a tripán-kék kizárási vizsgálattal meghatározott túlélési arányuk több mint 95 százalék. A timidin-kináz hiányos sejtvonal (U-937 /TK"/), egy emberi daganatos makrofág sejtvonal (3 X I07 sejt) (előállítását az 1. Referenciapéldában közöljük) sejtjeit a fentiekben leírt módon nyert monocitákkal keverjük össze, és a keveréket RPMI-1640-ben szuszpendáljuk. A sejteket a fehérje-komponens eltávolítása céljából centrifugálással mossuk. Ezt az eljárást kétszer megismételjük, majd a sejteket 3 ml RPMI-1640-ben szuszpendáljuk és 0,1 mg humán fibronektint adunk hozzá. A keveréket 30 percig hagyjuk állni széndioxidos inkubátorban. RPMI-1640 alkalmazásával a sejteket centrifugálással mossuk, majd Hank-féle oldatban készített 40 %-os polietilén-glíkol (molekulasúlya 2000) oldatot adunk a leülepedett sejtekhez. A sejteket ezután 60 ml HAT közegben [hipoxantint, aminoptelint és timidint tartalmaz; Liülefield J. W., Science, 145 709 (1964)] diszpergáljuk és 3 db 96 lukas lemezre visszük, majd széndioxidos inkubátorban (5 % széndioxid) 37 °C-on inkubáljuk. 25 nap elteltével megjegyezzük a sejtnövekedést mutató lukakat. A kromoszómaszám vizsgálatával igazoljuk, hogy ezek a sejtek fuzíonáltatott sejtek. Ezt a kromoszómaszám-vizsgálatot az alábbiakban közölt módszerrel végezzük. A kapott eredményeket az alábbi 1. táblázatban mutatjuk be. 1. táblázat Fúzió Sejtnövekedést mutató 50 vagy több módszere lukak száma kromoszómával (3X96=288 luk körül) rendelkező' sejtek százaléka Fibronektines kezelés 15 35-68 2. példa \z I. példában leírt módon nyert fúziós sejtvonal 1 u moi gál ló-anyag termelőképességét vizsgáljuk. A fúziós sejteket és kontrollként a szülő U-937 (T1Q és per fériális vér monocitákat (mindegyik 106 sejt mennyiségű) 1 ml, 7,5 % boíjú-magzat szérumot tartalmazó RPMI-1640 közegben szuszpendáljuk és 24 hikas műanyag lemezre osztjuk szét, majd 10pg/ml LPíi-t adunk hozzá. A sejteket 5 % széndioxidban 37 °C-on inkubáljuk, majd 20 órával az LPS hozzáadása után a felüiúszókat egyesítjük, és egér leukémia sejtekkel szembeni citotoxikus hatását vizsgáljuk. Az egér L sejtekre gyakorolt citotoxikus hatás meghatározására a tenyészet felülúszóját 100 pl-es adagokban 96 lukas műanyag lemezekre visszük, akár eredeti koncentrációban, vagy 1 % borjú-magzat szérumot tartalmazó MEM-mel (minimum eszenciális táp alaj) 2, 4, 8, 16, 32, 64 és 128-szorosra hígítva. Majd 10s egérsejtet 1 ml, 1 % borjú-magzat szérumot tartalmazó MEM-mel hígítjuk, a szuszpenzióból 10C pl-t adunk minden egyes lemezhez, majd 5 % széndioxidot tartalmazó atmoszférában 37 °C-on 2 I apig inkubáljuk. 20 pl 25 %-os glutáraldehidet adunk hozzá, majd szobahőmérsékleten hagyjuk állni 15 percig. Fixálás után a sejteket négyszer mossuk víz?el és 10 percig 50 °C-on szárítjuk. Ezután 100pl kristályibolya oldatot (0,2 %-os oldat 2 %etanolban) adu ík hozzá és a keveréket szobahőmérsékleten hagyjuk állni 15 percig. A sejteket négyszer mossuk vízzel és 10 percig 50 °C-on szárítjuk. Ezután 200 pl, 0,1 M din; trium-hidrogén-foszfát és etanol 1:1 térfogataráryú elegyét adjuk a sejtekhez, 3 percig szobahőmérsékleten rázogatjuk, és 610 nm-en mérjük az absrorbanciát. A kapott eredményeket a 2. táblázatban mutatjuk be. A táblázatban A-l, A-2 és Árjelentése perifériális vér monociták és U-937 (TK") sejtek fúziójából kapott fúziós sejtek telepei. 2. táblázat Sejt zonal Hígítási faktor a tenyészet felülúszójára egér L sejtek 50 %-os pusztulásánál A-l fúziós sejt vonal 10 A-2 fúziós sejt vonal 4 A-3 fúziós sejtvonal 8 U-9J7 (TK”) < 2 Peri "eriális vér monociták 2 3. példa A timidin-kináz hiányos THP-1 sejtvonalat használva, az 1. példában leírt módszert alkalmazzuk a perifériális vér monocitákkal (előállításuk leírása az 1. példában) való fúzió végrehajtására. A timidin-kináz hiányos THP-1 sejtvonalat (rövidítése THP-1 /TK7) a 2. referenciapélda szerint állítjuk elő, mint 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
