191397. lajstromszámú szabadalom • Eljárás biológiailag aktív anyagok előállítására hibrid sejtvonal tenyésztésével
5 191 397 6 fitohemagglutinint, alkörmös mitogént vagy hasonlót, kollagént vagy fibronektint tartalmazó közegben, 5 % szén-dioxidot tartalmazó atmoszférában 37 °C-on 5-60 percig. Ugv találták, hogy ezzel az előkezeléssel a makrofágok fúziójának hatékonysága említésre méltóan megnő. A megfelelő sejteket persze a keverés előtt hasonló módon, egymástól függetlenül előkezelhetjük. Jóllehet nem kívánatos az összetapadás, a fenti eredmények abból származnak, hogy az előkezelés láthatólag a sejtek aggregálódását okozza, ezáltal megnöveli a sejtek közötti kapcsolat hatékonyságát és így megjavítja a fúzió hatékonyságát. Ezután a fúziót meggyorsító anyagként 1500— 6000 molekulasúlyű polietilén-glikolt oldunk 35— 55 % koncentrációban fehérjémen tes közegben, vagy kiegyenlített sóoldatban és az oldatot lassan, cseppenként adagoljuk, 0,1—1 ml-t minden 107 össz-sejthez. A rendszert 2-3 percig hagyjuk állni, majd fehérjementes közeggel mossuk, hogy kellőképpen kihígítsuk a polietilén-glikolt. A sejteket tartalmazó közeget olyan közegben oszlatjuk el, melyben a teljes aminopterin érzékeny daganat-sejt populáció teljes pusztulását okozó aminopterin koncentrációtól a minimális letális koncentráció százszorosáig terjedő aminopterin, valamint a fuzionált sejtek szaporodását elősegítő hipoxantin és timidin található (továbbiakban HAT táptalaj-ként rövidítve), és a diszperziót 96-lukas mikroliter lemezre osztjuk szét. A lemezt szén-dioxidos inkubátorba helyezzük a fuzionált sejtek szaporítása céljából. Jóllehet abban a tartományban, ahol nincs citotoxikus hatásuk, a timidin és hipoxantin koncentrációja nincs korlátozva, előnyösen a körülbelül KP4 M és körülbelül 1,5 X 10^ M koncentrációban alkalmazzuk őket. A HAT táptalajban szaporodó sejteket elválasztjuk, hogy igazoljuk, hogy fuzionált sejtek. Lehetnek olyan esetek, mikor a timidin-kináz hiányos daganatsejtek a HAT táptalajban mutáció következtében visszaalakulnak timidin-kinázt tartalmazó sejtekké, melyek szaporodnak a HAT táptalajban. A fenti igazolás elősegíti, hogy az ilyen eseteket felfedezzük. A sejtfúziót úgy igazoljuk, hogy vizsgáljuk a kromoszómák számának növekedését, melyet ismert technikákkal határozhatunk meg, lásd például [M. Seabright et ú., The Lancet, 971-972 (1971)]. A nem daganatos humán makrofágok kromoszómaszáma általában 46, azaz a normál humán diploidok kromoszómaszáma. A humán daganatos makrofágok kromoszómaszáma szintén 46. A fuzionált sejtekben a kromoszómák száma több mint 46. Azonban az osztódás, szaporodás ismétlődésével azonban néhány kromoszóma elveszhet, ennélfogva nem mondhatjuk, hogy a 92-nél kevesebb kromoszómával rendelkező sejtek nem fuzionált sejtek. A fuzionált sejtekben a kromoszómaszám statisztikus eloszlású. A kromoszómaszám meghatározásához körülbelül 106 sejtet kezelünk a szokásos 107 M Colcemidet tartalmazó közegben 30-60 percig, majd hiopotóniás sóoldattal kezeljük, fixáljuk 1:3 térfogatarányú ecetsav-metanol eleggyel, hűtött üveg tárgylemezre csöppenjük, szárítjuk, Giemsa festékkel festjük és fénymikroszkóp alatt vizsgáljuk. A fuzionált sejtek által termelt biológiailag aktív anyag kimutatásához ezeket a sejteket serkentő anyagot, például LPS-t, konkanavalin A-t, fitohemagglutinint, alkörmös mitogént, A vitamint és származékait, fórból észtert, muramii dipeptidet, Calmette-Guerin bacillust, proteóz peptont, lentinant, pisibanilt, dimetilszulfoxidot vagy limfokint tartalmazó közegben tenyésztjük, és a tenyészet felülúszóját használjuk anyagként. Míg egyetlen fuzionált sejt különböző biológiailag aktív anyagot termel, a termelés képét különböző serkentő módszerekkel befolyásolhatjuk. Klónozási technikával az is elérhető, hogy egy bizonyos biológiailag aktív anyagot biztosítsunk megnövekedett mennyiségben. A tumorgátló anyagot egér leukémia sejteket használó cilotoxicilási vizsgálattal határozzuk meg, míg az interleukin-l-et a triciummal jelölt, timidin egér timocita általi felvételi sebességének meghatározásával vizsgáljuk (a DNS szintézisre gyakorit serkentő hatás meghatározása). Biológiailag aktív anyag előállítása fuzionált sejtvonallal. 1. A tumorgátló hatású anyagot illetően minden különböző szülősejtekből származó fuzionált sejt serkentés hatására egér L sejtekre roncsoló hatást mutató anyagot termel a tenyészetben, és az anyag aktivitása lényegesen magasabb, mint a szülő, humán daganatos sejtvonalé, és/vagy azonos szintű, vagy magasabb, mint a másik szülő, a humán nem-daganatos makrofágé. Ezek a fuzionált sejtek ezen felül képesek a szaporodásra. 2. Az interleukin-l-nél, mint a tumorgátló hatású anyagok esetében, a fuzionált sejtek aktivitása nagyobb, mint az emberi daganatos makrofág sejtvonalaké és/vagy azonos szintű, vagy még magasabb az emberi nem-daganatos makrofágokénái, és képesek szaporodni. így a találmány szerinti fúziós sejtvonalról bizonyított, hogy nagy mennyiségben tumorgátló anyagot és interleukin-l-et termel. Az a tény, hogy ez a fúziós sejt emberi sejtek hibridje és szaporodik, azt mutatja, hogy felhasználható ezen humán eredetű anyagok nagy mennyiségű előállítására. Ennek a fúziós sejtvonalnak a létrehozása megoldja a szakirodalomban eddig közölt összes olyan problémát, melyet eddig nehezen megoldhatónak hittek, azaz azt a nehézséget, hogy a rák és különböző immunbetegségek gyógyításában ígéretes anyagot nem lehet megfelelő mennyiségben előállítani, valamint az antigenicitás problémáját, mely akkor jelentkezik, ha nem-humán eredetű anyagot adunk be embereknek. A jelen találmánynak ennélfogva nagy jelentősége van az emberiség egészségének és jólétének fenntartásában. A következő példákat a jelen találmány további illusztrálása céljából adjuk meg, de nem tekinthetők a jelen találmány korlátozásának. Ha külön nem jelezzük, minden rész-, százalékarány és hasonló súlyra van megadva. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 4
