191397. lajstromszámú szabadalom • Eljárás biológiailag aktív anyagok előállítására hibrid sejtvonal tenyésztésével
3 191 397 4 Egy ilyen daganatos sejtvonal emberi nem-daganatos inakrofág sejttel való fúziójakor a daganatos sejtvonalat előzetes kezeléssel 5-bróin-dezoxi-uridinre rezisztenssé tesszük, és szelektálunk egy timidin-kináz hiányos sejtvonalat. Az eljárást a következőkben részletesen ismertetjük, lényege az, hogy lehetővé teszi a hibrid sejtek szaporodását és összegyűjtését. Alveoláris makrofágok, lép-makrofágok, máj-makroTágok, hashártya-makrorágok, méhlcpény-makrofágok, perifériális vér-monociták, csecsemőmirigy - makrofágok stb. használhatók emberi nem-daganatos makrofág sejtként. A makrofág sejtek azonban igen elterjedten fordulnak elő a test-szövetekben, ezért a fenti felsorolás nem tekinthető kizárólagosnak vagy korlátozónak. Ezeket az emberi nem-daganatos mak-i rofág sejteket könnyen kinyerhetjük szokásos módon az emberi szervekből. Míg az ilyen nem-daganatos ! makrofágokat általában adott állapotukban használjuk, a sejtfúziós eljárásban, természetesen előzetesen stimulálhatjuk stimulálószerrel, lásd [Proc.Natl.Acad. Sei, USA, 79, 5379-5383 (1982)]. A stimuláló szerek közé tartozik például egy lipopolis/.acharid (továbbiakban LPS), a konkanavalin A, fitohemagglutinin, alkörmös mitogén. A vitamin és származékai, forbol; -észterek, muramil-dipeptid, Calmette-Guerin bacilus, proteóz pepton, lentínon lentinon dodes vizes extraktuma, carcinostatikum), pisibanii (A-típusú streptococcus pyogenes penicillin G-kezelésével kapott carcinostatikum), dimetil-szulfoxid, limfokin stb. A fúziót úgy hajtjuk végre, hogy egy emberi makrofágból származó daganatos sejtvonalat egy emberi nem-daganatos makrofággal keverünk össze fémionáló-szer jelenlétében szobahőmérsékleten (kb. 20- 40 °C). Számos különböző fuzionáló anyag ismert, például a polietilén-glikol oldat, inaktivált Sendai vírus stb., amint azt például Taniyama és munkatársai [/. Exp. Med. 156, 1286-1291 (1982)], valamint Kolter és munkatársai [Nature, 256, 495 (1975)] ismertetik és jóllehet a használható fuzionáltató anyagok köre nincs korlátozva, egy polietilén-glikol oldatot könnyű elkészíteni és használni. A fúziót követően a nem fuzionált nem-daganatos makrofágok fokozatosan elpusztulnak és nem zavarják a hibrid sejtvonal összegyűjtését, de mivel a nem fuzionált daganatos sejtek nem pusztulnak el, némi találékonyságra van szükség a daganatos sejteknek a hibridsejtektől való elválasztásához. Jóllehet a hibrid sejtvonalat a fuzionálallan daganatos sejtvonaltól úgy is elválaszthatjuk, hogy agar táptalajra való hígítással különálló telepeket hozunk létre, és összehasonlítjuk a tulajdonságaikat, sokkal célszerűbb, ha a daganatos sejtvonalból előzetesen olyan enzimatikus defekttel rendelkező daganatos sejtvonalat szelektálunk, mely elpusztul aminopterint vagy/és azaszerint tartalmazó közegben, és ilyen hibás sejtvonalat használunk a fúzióhoz. Mivel egy aminopterin jelenlétében elpusztuló, enzimhibás daganatos sejtvonalat az azaszerin is elpusztítja, a jelen eljárást az alábbiakban csak aminopterinre írjuk le. Érthető, hogy a következő leírás ugyanúgy alkalmazható azaszerin re is. így a fúzió után szelektíven csak a hibrid sejtvonal képes szaporodni egy aminopterin-tartalmú közegben. Ha cgv olyan sejtvonalat hozunk létre, melynek a hipoxantin-guanin-foszforibozil-transzfcráz (rövidítése HGPRT) enzimje hibás, az képes szaporodni 8-azaguanint vagy 6-tioguanint tartalmazó közegben. Tinidin-kináz hiányos sejtvonal létrehozásához 5-bróm-dezoxi-uridint tartalmazó tápközegben szaporodni képes sejtvonalat szelektálunk. Mivel a reagens szükséges koncentrációja függ a használt scjtvonal érzékenységétől, az adott anyagra a sejteket először a reagenst különböző koncentrációba! tartalmazó közegben tenyésztjük, hogy meghatározzuk azt a reagens-koncentrációt, mely felére csökkerti a sejteknek a reagens jelenléte nélkül mért szaporodási sebességét, majd ezt a koncentrációt fokozatosan, 2-6 hónap alatt 20-100-szorosára növeljük. Az így előállított enzimatikusan hibás daganatos sejtvonal képtelen megélni aminopterint tartalmazó közegben. Ezt a daganatos sejtvonalat a továbbiakban anvnopterin-érzékeny daganatos sejtvonalként említjük Hogy megerősítsük azt, hogy az így kapott daganat as sejtvonal valóban egy aminoplcrin-érzékeny daganatos scjtvonal, ezért különböző koncentrációban aminopterint tartalmazó közegben tenyésztjük 15 napig, hogy igazoljuk azt, hogy daganatos sejtek teljesen elpusztulnak, és meghatározzuk ennek a hibás dagmatos sejtvonalnak a letális aminopterin koncentrációját. Kívánatos, hogy a fúzió után a szelektáló táptalajban levő aminopterin koncentrációja százszor magasabb legyen, mint az a minimális letális koncentráció, mely 15 nap alatt elpusztítja a teljes hibás daganat sejt populációt. A sejtfúziós technikát az alábbiakban részletesen ism rtetjük. Az emberi nem-daganatos makrofágokat különböző emberi szervekből izolálhatjuk. Perifériális vér moüociták kinyerésénél Ficoll-Conray gradiensen 400xg-vel 30 percig végzett centrifugálással kapjuk középső frakcióként a perifériális vér-limfocitában gazdag frakciót. Peritonális makrofágokat aszcitesz rete adóban szenvedő beteg, aszciteszéből centrifugálva gvűjthetjük össze. Lép-, csecsemőmirigy-, méhlepény-, vagy máj-makrofágokat az izolált szövet felvagc’alásával, a szilárd frakciónak rozsdamentes acél szitán való kinyerésével nyerhetünk, a szennyező eritroci ákat 0,14 mólos vizes ammónium-kloriddal elro rcsolva, a sejteket sejt-tenyésztő közegben szuszpcndálva, majd a szuszpenziót borjúmagzat-szérummal bevont műanyag lemezen elporlasztva, majd néhány óra elteltével leválasztjuk a műanyag lemezről a tapadó sejteket tripszinnel vagy etilén-diamin-tetraacetittál. Az alveoláris makrofágok előállításánál a broi chopulmonáris öblítés alveoláris mosását használjuk közvetlenül. Az emberi nem-daganatos makrofágokat tartalmazó, fentiek szerint nyert szuszpenziót ezután aminop'erin-érzékenv daganatos sejtvonallal keverjük ossza, és a fehérje-komponenseket beleértve a borjúmagzat szérumot teljesen eltávolítjuk a centrifugálással. \ két különböző fajta sejt keverési aránya (sejtszán ) nem korlátozott, és körülbelül 100: I -tői körülbelü' 1: 100-ig terjedhet. A sejtkeveréket ezután előinkubáljuk szérum-mentes, 1-1000 jug/ml fitoagglutinint (például Con A), 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
