191371. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új muramil-peptid-származékok és ezeket a vegyületeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 191 371 2 lünk. A nyersterméket 14 ml futtatószerben oldjuk és az oszlopra öntjük. Kétszer 500-500 ml eluálószer átengedése után 10 ml-es frakciókat fogunk fel. A 133-152, illetve 153-236 frakciókban levő anyagot külön-külön összegyűjtjük és dializáló szűrésnek vetjük alá. A főfrakciónál következőképpen járunk el: az anyagot 300 ml kétszer desztillált vízben oldjuk, rövid ideig melegítjük 40 °C-on és az oldhatatlan diciklohexil-karbamidot lehűtés után centrifugálással távoiítjuk el. A felülúszó anyagot egy dializáló cellába (gyártó: Amicon Corporation, Danvers, Massachussets 01932, USA, 402 modell, ultraszűrő PM/10/76 mm <f>, inert, nem-ionos, poliszulfonbázisú polimer, közepes pórusnagyság 10 A) helyezzük és 4 bar túlnyomáson 1,5 liter kétszer desztillált vízzel, 0,5 liter 1:1 arányú foszfát-puffer-nátriumklorid eleggyel (egyaránt 0,1 mólos töménységűek, pH = 7) és 1.5 liter vízzel szemben kloridmentcsrc dializáljuk. A belső dializátumot (70 ml) Millipore-szűrővel (0,2 ß) sterilre szűrjük és liofilizáljuk. Így 4,13 g (az elméleti hozam 67 %-a) N-acetil-muramil-L-alanil-D-glutamil(Ca)-n-butil-észter-(C7)-L-alanin-2-(l,2-dipalmitoil-sn-g!icero-3-hidroxi-foszforií-oxi)-ctilamid-nátriumsót kapunk (3,4 mól H20) színtelen por alakú anyag formájában. [ajp0 =+14°±1° (c = 0,44; vízben), Rf = 0,37 (kloroform-metanol-víz, 70:30:5 rendszerben) és Rf = 0,64 (etilacetát-n-butanol-piridin-ecetsav-víz, 42:21 :21 :16:10 rendszerben) Elemanalízis a C63Hus02oNsPNa-3,41 H20 (1381,63) képlet alapján: számított: C 54,77 %, H 8,94 %, N 5,07 %, P 2,24 %, Hí O 4,71 %; talált: C 54,3 %, H 9,1 %, N5,6%, P 2,3 %, H20 4,7 %. Elemanalízis a C63HnsO20N5PNa (1316,59) képlet alapján: számított: Na 1,75 %; talált: Na 1,57%. A kiindulási anyagot a következőképpen állítjuk elő: 5,5 g (8,1 mmól) 4,6-0-izopropilidén-N-acetil-muramil - L - alanil - D - glutaminsav - (Ca) - n - butil - (C7) - benzil-észtert oldunk 60 ml 60 %-os ecetsavban és egy éjszakán át hagyjuk állni szobahőmérsékleten. Az enyhén sárga színű oldatot forgóbe párol ón, 30 °C-on, körülbelül fele térfogatúra pároljuk be, 300 ml dioxánt adunk hozzá, majd liofilizáljuk. A nyerstermék 4,8 g-ját (~7,5 mmól) 100 ml 9:1 arányú dimetoxi-etán-víz elegyben oldjuk, 0,8 g palládiumoxid-szén (10 %-os) katalizátort adunk hozzá éz négy órán át hidrogénezzük. A katalizátort kiszűrjük, a szfírletct szárazra pároljuk és a a maradékot 60 jelű szilikagélcn 70:30:5 arányú kloroíörm-metanol-víz eleggyel. történő kétszeri kromatografálással tisztítjuk (Merck, 1:200, 10 ml-es és 5 ml-es frakciók). A terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük és az oldószert lepároljuk. A részben nátriumsó alakjában jelenlevő nyersterméket 40 ml kétszer desztillált vízben oldjuk és 50 ml jól előre tisztított, erősen savas ioncserélővel (Dowex 50 W X8, 0,15-0,3 mm szemcseméret, H-form) kezeljük és az oszlopot teljes 100 ml kétszer desztillált vízzel utána mossuk. Az eluátumot Millipore-szürőn (0,2 ß) szűrjük és liofilizáljuk. így 3,7 g (az elméletileg számított 69 %-a) N-acetil-muramil-L-a!anil- D-glutamin-sav(Ca>n-butilésztert kapunk színtelen por alakú anyag formájában. A termék 0,6 mól kristályvizet tartalmaz. [a]10 = +45°±1° (c = 1,142; metanolban) Rf = 0,23 (kloroform-metanol-víz, 70 :30:5, rendszerben) és Rf = 0,40 (n-butanol-ecetsav-víz, 75 :7,5 :21 rendszerben). A kiindulási anyagot a következőképpen állítjuk elő: 4,4 g (11 mmól) N-acetil-4,6-0-izo-propilidén-muraminsav-nátriumsót (2,5 mmól/g) 60 ml vízmentes dimetil-formamidban szuszpcndálunk. Erős keverés közben egymást követően 4,4 g (11 mmól) Dalanil-D-glutaminsav - (Ca) - n - butilészter - (C7) - benzilészter - hidrokloridot, 2,53 g (22 mmól) N-hidroxi-szukcinimidet és végül 2,5 g (12,1 mmól) diciklo-hexil-karbodiimidet adunk hozzá és egy éjszakán át keverjük szobahőmérsékleten. A szuszpenziót 100 ml ecetsav-etil-észterrel hígítjuk, fél órán át keverjük 0 °C-on, majd az oldhatatlan csapadékot kiszűrjük (diciklo-hexil-karbamid, nátriumklorid). A szűrletet nagy vákuumban, 30 °C-on bepároljuk, a maradékot 400 ml etilacetátban oldjuk és tízszer extraháljuk, 50—50 ml kétszer desztillált vízzel. A szerves fázist szárítjuk, az oldószert lepároljuk, így 5,6 g (az elméleti hozam 75 %-a) N-aceti!-4,6-0-izopropilidén-L- alanil - D - glutaminsav - (Ca) - n - butil - észter - (C7)benzilészlert kapunk amorf por alakú anyag formájában. [a]p° = +30°±1° (c = 0,732; metanolban) Rf = 0,87 (kloroform-metanol-víz, 70:30:5 rendszerben) és Rf = 0.83 (n-butanol-ecetsav-víz, 75 :7,5 :21 rendszerben). A kiindulási anyagot a következőképpen állíthatjuk elő: 5,6 g (12,1 mmól) N-terc-butil-oxi-karbonil-l^alanil- D-g1utaminsav-(C0()-n-butilészter-(C7)-benzilésztert oldunk 20 ml vízmentes ecetsav-etil-észterben, majd erős keverés közben a nedvessség kizárása mellett 50 ml 4,5 n sósavas etilacetátot csepegtetünk hozzá és a reakcióelegyet egy órán át hagyjuk állni 0°C-on. A sárgás színű oldatot szobahőmérsékleten körülbelül 20 ml térfogatúra pároljuk be, 150 ml dioxánt adunk hozzá és liofilizáljuk. így 4,75 g (az elméletileg számított 97 %-a) L-alanil-D-glutaminsav-(Ca)-n-butilészter-(C7)-benzil-észter-hidrokloridot nyerünk, síntelen olajos anyag alakjában. t ■ [a]y° = +19°±1° (c = 0,313; metanolban) Rf = 0.58 (kloroform-metanol-víz, 70:30:5 rendszerben) és Rf = 0,56 (etilacetát-n-butanol-piridin-víz, 42 :21:6:10 rendszerben). A kiindulási anyagot a következőképpen állítjuk elő: 8,5 g (25,8 mmól) D-glutaminsav-(Ca)-n-butil-észter(C7)-benzil-észter-hidroklorid és 7,4 g (25,8 mmól) N-terc-butil-oxi-karbonil-L-alanin-N-hidroxi-szukcinimidészter 150 ml vízmentes dimetil-formamiddal készített 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 8
