191310. lajstromszámú szabadalom • Javított eljárás tiolcsoportot tartalmazó peptidek cianobromidos hasítására
1 191 310 2 A találmány olyan javított eljárás, amely a tiolcsoportot (—SH) tartalmazó peptidck cianobromidos hasításánál gátolja a nem-kívánatos tiol-reakciókal. A rekombináns DNS metodika megjelenése magával hozta egész sereg eljárási paraméter fejlesztésének szükségességét a termék előállításában, visszanyerésében és tisztításában. A rekombináns DNS eljárásokkal kapott termékeket szokás szerint „génfúziós termékck”-ként nyerik, azaz olyan aminosav szekvenciákként, ^melyek egy vezető szekvenciát és/vagy egy követő szekvenciát tartalmaznak, mely a kívánt termék aminosav szekvenciájához kapcsolódik. Alapvetőnek mutatkozott, hogy a kívánt peptidnek bármely idegen peptidtől való hasítására metodikát dolgozzanak ki. Ho és munkatársai [Synthetic Comm., 3, 317—320 (1973)] a cianobromidot (CNBr) használják egy pepiidben levő metionin karboxil-végénél levő peptidkötés hasítására. Amennyiben a metionin a kívánt termék amino-láncvégéhez kapcsolódik, és az idegen pepiid karboxi-láncvégét képezi, ugyanakkor a kívánt termékben nincsenek hozzáférhető metioninmaradékok, a cianobromidos hasítás igen hasznos módszer a rekombináns DNS eljárások termékének preparálásakor. Mindemellett a cianobromid használata az említett hasítás kivitelezésére hátrányokkal is rendelkezik. Egy ilyen hátrány jelentkezik az olyan peptidek alkalmazása esetén, amelyeknek tioltartalmű aminosavmaradékaik vannak. Ismeretes, hogy a cianobromid elősegíti a tiolok diszulfidokká való átalakulását, és ezáltal a cianobromidos hasítás során nem-kívánatos melléktermékekhez is vezet. Ho és munkatársai [Synthetic Communications, 3, 317-320 (1973)] írják le a cianobromid reakcióját alkil- és anl-nátrium-tiolátokkal, amelyek során a megfelelő diszulfidok keletkeznek. Abe és munkatársai [J. Org. Chem., 39, 253- 255 (1974)] homocisztin és 2-merkapto-etanol reakcióját írják le, melynek során Jiomocisztcin és a liöinocisztein és 2-mcrkapto-etanol vegyes diszulfidja keletkezik. A reakció cianobromid jelenlétében és távollétében egyaránt lejátszódik. A vegyes diszulfid menynyisége a cianobromid jelenlétében nagymértékben megnő, a homocisztein mennyiségének arányos csökkenése mellett. Sekita és munkatársai [Keio J. Med., 24, 203-210 (1975)] az urcáz és a foszforiláz cianobromidos hasítását írják le. Vizsgálataikból kitűnik, hogy 2-mcrkapto-etanol hozzáadásával növelhető a hasítás hatásfoka; minden esetre azonban e hatás okára nézve nincs feltételezésük. Azt is leírják továbbá, hogy e hatás nem érhető el, ha ditiotreitet vagy tiodiglikolt használnak. Azt találtuk, hogy a cianobromid által okozott nem-kívánatos diszulfid átalakulás és az irreverzibilis cisztein módosulás a rekombináns DNS eljárás során nyert, fermentációs termékekben csökkenthető vagy kiküszöbölhető, ha a reakcióelegynek cianobromidos hasítást megelőzően csekély mennyiségű tioszulfát iont adunk. A tiol-tartalmú peptidek rekombináns DNS eljárásokkal való előállítása rendszerint a rekombináns szervezetek fermentációját, a fermentléből a szilárd anyagok kinyerését, a génfúziós termék cianobromidos hasítását és a hasított termék szulfitolizisét öleli fel. így olyan S-szulfonált pepiidet nyerünk, amely egy függetlenül nyert S-szulfonált peptiddel kombinálható vagy önmagával kapcsolva adja a kívánt diszulfid tartalmú terméket. A termékek így nyert keverékének szulfitolizise során megfigyeltük, hogy a cianobromid hatása a tiol-tartalmú anyagokra olyan jelentős mennyiségű irreverzibilisen módosított származékok keldkezéséhez vezet, ami bonyolítja a kromatográfiás tisztítás műveleteit és csökkenti a kitermelést. Ily módon mind termékveszteség, mind pedig kromatográfiásan hasonló szennyezések állnak elő. E hátrányok közül — felismerésünk szerint — mindkettő számottevően csökkenthető vagy kiküszöbölhető a tioszulfát ion jelenlétével. Azt találtuk továbbá, hogy a tioszulfát ion használata tiolcsoportokat tartalmazó peptidek cianobromidos hasításánál további előnyökkel is jár. Az eljárás során egy közbenső termék, feltehetően a szulfenil-S- szulfonát keletkezik, amely megkönnyíti a szokás szerint soron következő szulfitolízis-reakciót. A szulfitolízis hagyományosan abból áll, hogy a tiol-tartalmú peptidet nátrium-szulfittal kezeljük oxidálószer jelenlétében, amelyek közül a legelőnyösebbnek a nátriumtetrationát mutatkozott. A cianobromidos hasítás alatt a tioszulfát jelenléte következtében keletkező közbenső termék a költséges nátrium-tetrationát nélkül is könnyen szulfitolizált termékké alakítható nátrium-szulfitos kezeléssel. Ily módon jelen találmány tárgya egy olyan hasítási eljárás, amelynek során a tiolcsoportot (—SH) tartalmazó peptidek cianobromidos metionil-hasítását tioszulfát ion jelenlétében végezzük. A találmány szerinti reakcióelegy egy peptidet, cianobromidot és tioszulfát iont tartalmaz. A peptid legalább egy cianobromiddal megtámadható és karboxil-végénél hasítandó metionint és legalább egy tiolcsoportot tartalmazó aminosavat tartalmaz. Azokra a peptidekre, amelyek fentebbi követelményeknek eleget tesznek, példaként szolgálnak; a növekedési hormonok, a proinzulinok, az inzulin A-lánca és az inzulin B-lánca. A találmány szerinti hasítási reakciót vizes-savas oldószerben vitelezzük ki. A használható jellegzetes savak: trifluor-ecetsav, ecetsav, sósav, kénsav, foszforsav, hangyasav és hasonlók. A hangyasav használata különösen előnyös. Bár más, nem vizes és nem savas oldószereket is tartalmazhat az oldószcr-elegy, különösen előnyös, ha a sav arányát a vízhez gondosan ellenőrizzük. Akár tartalmaz az oldószer-elegy nemsavas, nem-vizes alkotórészeket, akár nem, célszerűen a jelenlevő sav a vízhez képest mólfeleslegben van. A hangyasav esetében az előnyös sav-víz elegy a67,5%-os (térfogat) hangyasav-tartalmú oldat. A cianobromidból az elegyben célszerűen olyan mennyiség van jelen, ami legalább 1—1 mólnyit biztosít a peptid kiindulóanyagban levő minden metioninmaradékra vonatkozóan. A cianobromidból nagy felesleg minden káros kihatás nélkül alkalmazható; ezért általában a cianobromid a pepiidben levő összes mcliouil-muiadékhoz képcsl 6— J0-szcres mólaránybau kerül alkalmazásra. Amennyiben cianobromidból nem használnánk annyit, amennyi normális körülmények között fölöslegnek számítana, e találmány értel5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
