191310. lajstromszámú szabadalom • Javított eljárás tiolcsoportot tartalmazó peptidek cianobromidos hasítására
3 191 310 4 mében további olyan mennyiségű cianobromidot kell az elegyhez adni, amely az elegyben levő tioszulfát ionhoz képest az egyenlő mólarányt biztosítja. Mindenesetre legalább annyi cianobromidot kell alkalmazni, hogy a motion in-maradékra és a tioszulfálra : vonatkoztatva ezek mólösszegét jóval meghaladó i felesleget alkalmazunk. ; A találmány szerinti eljárás lényege a tioszulfát ion hozzáadása. A tioszulfátot jellegzetesen szervetlen sójának alakjában adagoljuk, általában alkálifémsó, például nátrium-tioszulfát, kálium-tioszulfát és hasonlók formájában. Előnyös a nátrium-tioszulfát. A használt tioszulfát mennyisége közvetlenül az elegyben levő tiol mennyiségének függvénye. Legalább egy mól tioszulfátot kell egy mól tiolra alkalmazni, és amennyiben a reakcióelcgybcn nukleofil jvcgyiilclck is jelen vannak, további megfelelő tioszulfát mennyiség szükséges ezek miatt és semlegesítésükre. Ezért célszerűen tioszulfát felesleg alkalmazható például a tiol-tartalom!a vonatkoztatva egészen a tízszeres mennyiségig, káros hatás nélkül. Noha az eljárásban alkalmazható tioszulfát mennyiségnek nincs felső határa, mégis — miután a tioszulfát cianobromidot fogyaszt — túlzott feleslege a normál feltételek melletti cianobromid szükségletet messze meghaladó mennyiséget igényel. A tioszulfát mennyiségét ezért előnyösen úgy választjuk meg, hogy a ciano: bromid felesleges felhasználását elkerüljük. ! A találmány szerinti eljárással a hasítási reakciót 15 °C-tól a cianobromid forráspontjáig (35 °C körül) terjedő hőmérsékleten vitelezzük ki. A reakciót előnyösen 15 °C és 30 °C közötti, és leginkább előnyösen ! 20 °C és 25 °C közötti hőmérsékleten vitelezzük ki. A reakciót a hasítás tökéletes végrehajtásáig szükséges ideig végezzük, általában 12 óráig terjedően. Normális körülmények között a reakció 6 óra elteltével tökéletesen lezajlik. A hasítás teljes lezajlása után a reakcióelegyet általában 25 °C körüli hőmérsékleten, csökkentett nyomáson csaknem szárazra pároljuk. A maradékot vízben oldjuk az eredeti töménység kétszeresének mértékéig, és az oldatot Üofilizáljuk. A liofilizált nyers, szilárd maradék szulfitolízisét általában 50g/l termék 7 mól karbainid oldatban való oldása esetén 0,1 mól nátrium-szulfit, 1 mmól cisztein és 0,1 mól etiléndiamin jelenlétében 8,5 pH-értéken, 22 °C-on, 8 órán keresztül végezzük. A következő példák arra hivatottak, hogy a találmány szerinti eljárást szemléltessék. Mindezek a találmány széles terjedelmét nem szándékoznak korlátozni. A példákban használt kiindulási anyagok minden esetben egy változó hosszúságú peptid-láncot tartalmaznak, melynek C-terminális aminosava Met. A metionin karboxilcsoportjához kapcsolódik peptidkölésscl a kívánt peptid-szckvencia, mely a következő: ' Inzulin A-lánc: Gly-lle-Val-Glu-GIn-Cys-Cys-Thr-Scr-Ilc-Cys-Ser-Lcu-Tyr-Gln-Leu-Gln-Asn-Tyr-Cys-Asn Inzlin B-lánc: NH2-Phe-Val-Asn-Gln-His Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu- Val-Gln-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Gln-Arg-Gly- Phe-Phc-Try-Thr-Pro-Lys-Thr 1 Humán proinzulin: Inzulin B lánc (1—30) -Arg-Arg Glu-Ala-Glu Asp-Leu- Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly Gly-Gly Pro Gly-Ala- Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Gln-Gly-Ser-Leu-Gln- Lys-Arg-Inzulin A-lánc. 1. példa Inzulin A-lánca hasított génfúziós termékének előállítására Az inzulin A-lánc liofilizált fermentié [előállítását lásd: Gocddel és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 76, 106-110 (1979)] 500 mg-jához 10 ml 67,5 %-os (tf/tf) hangyasavat adunk. Ehhez 15 perces keverés után 15 mg (3%-ot súly/súly arányban a liofilizált fermentlérc számítva) nátrium-tioszulfát-pentahidrálol adunk. A nátrium-tioszulfát feloldódását követően 0,05 mól (53 mg) koncentrációig cianobromidot adunk hozzá. A reakció 22 °C-on 12 óra alatt teljesen lezajlott. Az anyagot vákuumban bepároljuk, eredeti töménységéhez képest kétszeres mennyiségű vízzel oldjuk és üofilizáljuk. 2. példa Inzulin B-lánca hasított génfúziós termékének előállítása A B-lánc (előállítását lásd a fenti cikkben) lioflllzált fermentié 900 mg-jához 67,5 %-os (tf/tf) hangyasavat adunk. Ehhez 15 perces keverés után 27 mg (3% súly/súly arányban a szilárd fermentlérc számítva) nátriuni-tioszulfát-pcntahidrátot adunk. A nátriumtioszulfát feloldódását követően 0,10 mól koncentrációig (106 mg) cianobromidot adunk hozzá. A reakció 22 °C-on 12 óra leforgása alatt tökéletesen lejátszódott. A mintát vákuumban bepároljuk, vízzel eredeti töménységének kétszeresére hígítjuk és liofilizáijuk. 3. példa Proinzulin hasított génfúziós termék előállítása A proinzulin liofilizált fermentié (előállítását lásd a 4 430 266 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban) 1 g-jához 10 ml 67,5%-os (tf/tf) hangyasavat adunk. 15 perces keverés után 30 mg (a nyers szilárd fermentié 3 súly/súly%-a) nátriumtioszulfát-pentahidrátot adunk hozzá. A nátriumtioszulfát feloldódása után 0,10 mól koncentrációig (106 mg) cianobromidot adunk hozzá. A reakció 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
