191085. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 3-(5'-ribonuleotid)-származékok előállítására
1 191 085 2 A találmány tárgya eljárás olyan linkomicin- és klindamicintípusú vegyületek új 3-ribonukleotidjainak előállítására, melyek molekulájában a propil-liigrinsav egységet különböző ciklusos arninosavak helyettesítik. A linkomicin antibiotikum sajátságait és előállítását a 3 086 912 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás közli. A klindamicint a 3 486 163 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírásban oltalmazzák. Ezeknek az antibiotikumoknak kiterjedt terápiás alkalmazásuk van mipd az ember-, mind az állatgyógyászatban. Világszerte számos szabadalmat adtak meg, melyek ezen antibiotikumokra és sokféle származékukra vonatkoznak. A 3 671 647 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás közli a linkamicin és klindamicin 3-nukleotidjait. E szabadalmi leírásban közölt valamennyi linkomicin- és klindamicin-származék közös szerkezeti egysége a propil-higrinsav. Az S. aureus-on végzett in vivo kísérletek megmutatták, hogy e 3-nukleotidoknak a hatékonysága az alapvegyület hatásának megközelítőleg tizedrésze. A találmány szerinti vegyületek az (1) általános képletei vegyületek 3-(5’-ribonukleotid)-szánnazckai. Az. (1) általános képletben R jelentése (a), (b), (c) vagy (d) képlett! csoport. A találmány értelmében az (1) általános képletű vegyületeket úgy állítjuk elő, hogy a Streptomyces rochei NRRL 3533 letéti számú törzset megfelelő tápanyagokat tartalmazó vizes közegben tenyésztjük egy olyan (1) általános képletnek megfelelő vegyület jelenlétében, amelynek képletében R jelentése hidrogénatom, majd a tenyészet közegéből elkülönítjük a kívánt S-^’-ribonukleotid)származékot. Meglepő módon úgy találtuk, hogy a találmányunk szerinti nukleotidok in vivo baktériumellenes hatékonysága ugyanaz, mint az alapvcgyülctcké. Mivel ezek a sajátságok nagyon lényegesek, a találmány szerinti nukleotidokat főként terápiás felhasználásra tartjuk alkalmasnak. E vegyületek alkalmazhatók olyan egyének megelőző és terápiás ellátására, akik protozoa-típusú parazitát hordoznak. így például, ha a protozoa maláriaparazita, akkor ez állatokat is megbetegíthet: egerek például fertőzve lehetnek Plasmodium bcrghci-vcl; madarakat, így például a kacsákat fertőzheti P. ophurae, csirkéket a P. gallinacium; az emlősök közül a majmokat megtámadhatja a P. cynomolgi, az embereket pedig fertőzheti a P. falciparum, P. vivas és P. malariae. A Sporozoa osztály Coccidia rendjéhez tartozó (ez a mikroparazita idézi elő a kokcidiózist) protozoa-típusú paraizitákat hordozó emlősök a találmány szerinti vegyületek adagolásával kezelhetők. E vegyületek az állatgyógyászatban például a következő esetekben alkalmazhatók: Ejmeria zurnii-, E. bovis- és E. ellipsoidalis-val fertőzött szarvasmarha; E. parva- és E. faurei-val fertőzött birka és kecske, E. debliecki-, E. scabra- vagy Isospora suis-sal fertőzött sertés, Isospora bigemina-.l. felis-, E. canis-, vagy E. felina-val fertőzött kutya és macska; E. tenella-val fertőzött baromfi; E. stiedae- vagy E. perforans-val fertőzött nyúl; és E. mustelae-val fertőzött menyét. Azon linkomicin és klindamicin-származékok. amelyek 3-ribonuklcotidokká alakíthatók, az 1. mellékletben találhatók. A linkozaminid egység 3-helyzetű hidroxilcsoportja helyett a molekula nukleotidként adenilsavat, guanilsavat, citidilsavat vagy uridilsavat tartalmaz. Az 1. mellékletben definiált alapvegyületek az egyesült államokbeli 4 278 789 számú szabadalmi leírásban leírt eljárások segítségével állíthatók elő. Az 1. mellékletben közölt vegyületek 3-(5'-ribonukleotidj-származékai a 3 671 647 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírásban közölt eljárások segítségével készíthetők. Ugyanezen szabadalmi leírás módszereinek követésével állíthatjuk elő c nukleotidok sóit is. A találmány szerinti nuklcotidokból úgy állíthatók elő gyógyszerkészítmények, amint ezt a 4 278 789 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás kompozícióra vonatkozó példái leírják. E készítmények úgy formulázhatók, hogy ezekben a példákban szereplő hatóanyagot egy találmány szerinti nukleotiddal helyettesítünk. Ezt a helyettesítést molckula-egyenértékek alapján végezzük. A találmány szerinti nukleotidok meghatározására és jelemzésére a következő általános és különleges módszerek alkalmazhatók. 3-(5'-ribonukleoticí)-szdrmazékok mérése Mivel a találmány szerinti 3-ribonukleotidoknak in vitro baktériumellenes hatásuk nincsen, ezért a baktériumellenes hatású kiinduló vegyületből való képződésük könnyen követhető úgy, hogy az antibiotikus hatékonyság csökkenését megmérjük. A baktériumellenes hatású kiinduló vegyület kultúraszűrletekben, vagy reakcióelegyekben való mennyiségi meghatározására a Sarcina lutea ATCC 9341 törzzsel végezhető szabványmeghatározást használjuk. A 3-ribonukleotidoknak fermentlevekben, kivonatokban és tisztított anyagokban való jelenléte esetén a meghatározást úgy végezzük, hogy előbb a foszfodiészter-kötést hidrolizáljuk nyers alkálikus foszfatázzal vagy kígyómércg-foszfodiésztcrázzal, az alább leírt eljárások szerint. A hidrolizátumban lévő, baktériumellenes hatású vegyületet standard módszerrel határozzuk meg. Enzimes hidrolízis Alkálikus foszfatáz: törzsoldatot (0,5 mg/ml, 0, 54 cgység/mg) készítünk galambból alkálikus foszfatázából IEC 3.1.3.1 (Sigma)/ trisz(hidroximetil)-aminometán hidroklorid (a következőkben: Tris) pufféróldattal, 0,01M, pH értéke 8,0. A vizsgálandó mintákat 1:2 arányban hígítjuk az cnzim-pufferkevcrékkel, majd 28 °C hőmérsékleten 18 órán át inkubáljuk. Kígyóméreg-foszfodiészteráz: törzsoldatot (100 mg/ml, 0,026 egység/mg) készítünk tisztított kígyóméreg-foszfodiészterázból /EC 2.1.4.1 (Sigma)/desztillált vízzel. Az inkubációs elegy tartalma: 0,2 ml a vizsgálandó minta 1 mg/ml koncentrációjú vizes oldatából, továbbá 0,6 ml 0.0IM Tris puffer, melynek pH értéke 9,0, továbbá 0,1 ml 0,3M magnézium-klorid-oldat és 0,1 ml enzimtörzsoldat. Az inkubálást 37 °C hőmérsékleten 18 órán át végezzük. Lép-foszfodiészteráz: törzsoldatot (1 mg/ml, 19,6 egység/mg) készítünk lép-foszfodiészterázból /EC 3.1.4.18 (Sigma)/ desztillált vízben. Az inkubációs elegy tartalma: 0,4 ml a vizsgálandó minta 0,5 mg/ml koncentrációjú vizes oldatából, továbbá 0,5 ml 0,02M Tris puffer, melynek pH értéke 7,0 és 0,1 ml enzim-törzsoldat. Az inkubálást 37 °C-on 18 órán át végezzük. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 56 60 65 2
