191085. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 3-(5'-ribonuleotid)-származékok előállítására
3 191 085 4 A készítmények és az enzimes hidrolizátumok vékonyrétegkromatográfiás (a továbbiakban: VRK) elemzése A 3-ribonukleotidok termelését és tisztítását úgy követjük nyomon, hogy S. lutea ellenében mérjük (lásd fentebb), továbbá VRK meghatározás útján. A VRK- hoz adszorbensként szilikagél G-t, és (futtatószerként) butanon-aceton-víz (186 :52 :20, térfogat/térfogat) vagy butanon-aceton-víz (8:5:1, térfogat/térfogat) elegyeit használjuk. A biológiailag hatásos kiinduló anyagokat S. lutea-val oltott agaron bioautográfiával detektáljuk. A 3-nukleotidok enzimes vagy kémiai hidrolízistermékeit a következő VRK rendszerek segítségével választjuk el: A: szilikagél GF lemez (Aualtech Inc.), futlalószcr víz; B: szilikagél FG lemez, futtatószer n-propanol, tömény ammónium-hidroxid és víz 55:10:35 (térfogat/térfogat) arányú elegye; C: NM-Polygram Cellulose 300 (Brinkman Instruments Inc.) lemez, futtatószer 1-butanol, víz és hangyasav 77 :13 :10 (térfogat/térfogat) arányú elegye. Az UV színképterületen elnyelő anyagokat rövid hullámhosszú UV lámpa segítségével detektáljuk. A biológiailag hatástalan, UV területen nem-abszorbeáló anyagokat permanganátperjodát permetreagenssel mutatjuk ki. A biológiailag aktív nuklcotidokat S. lutea-val oltott agaron bioautográfiával detektáljuk. Az alábbi példa bemutatja a fermentációs és tisztítási eljárásokat az U-57 930, illetve az U-57 930E jelzésű vegyület nukleotid-származékainak előállítására során. Az 1. mellékletben definiált többi vegyület 3-ribonukleotidjai e példában közölt eljárásokkal vagy ezekkel egyenértékű eljárásokkal állíthatók elő. (Az U-57 930E jelű vegyület az U-57 930 jelű vegyület hidrokloridsója.) A találmány szerinti eljárás részletesen ismertetjük az alábbi kiviteli példában. Ha külön megjegyzést nem teszünk, akkor a százalék tömegszázalékot, oldószerek aránya pedig mindig térfogati arányt jelent. 1. példa A) A fermentációs eljárás Streptomyces rochei NRRL 3533 törzset tenyésztünk egy közegben, mely a következőket tartalmazza: 10 g/liter glükóz, 4 g/liter Difco-pepton, 4 g/liter Difco élesztőkivonat, 0,5 g/liter MgS04 ■ 7^0, 2,0 g/liter KH2PO4, 4 g/liter K2HPO4. A tenyészetet forgó rázógépen, 28 °C hőmérsékleten 3 napon át tartjuk. E tenyészetből származó micéliumot használjuk fel az azonos alkatrészeket tartalmazó fermentációs közeg oltására. A fermentációt 48 órán át, 28 °C hőmérsékleten, forgó rázógépen végezzük. A 48 órás inkubálás végén 50 mg/liter koncentrációhoz elegendő U-57 930 vegyületet /(l) képletű vegyület, melyben R jelentése hidrogénatom/ adunk hozzá, majd a fermentációt 32 DC hőmérsékleten folytatjuk. 12 óra elmúltával további U-57 930 vegyületet adunk hozzá olyan mennyiségben, hogy a koncentrációja 150 mg/liter legyen. További 12 óra eltel«............................. - ..............1 tével az U-57 930 koncentrációját 250 mg/literre növeljük. A fermentációt 32 °C hőmérsékleten 24 órán át végezzük az U-57 930 utolsó részletének hozzáadása után, Ebben az időpontban végzett mérés azt mutatja, hogy a kultúraszűrlet legfeljebb 1 mg/liter U-57 930 vegyületet tartalmaz, tehát e vegyület fennmaradó része, azaz 249 mg/liter, biológiailag hatástalan vegyületté alakult át. Az S. rochei NRRL 3533 ismert mikroba, mely általánosan rendelkezésre áll, igénylés esetén, az NRRI bankban. E bank címe: Northern Utilization and Research Division, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture, Peoria, 111. USA. B) Elkülönítési és tisztítási eljárások Az U-57 930 3-ribonuklcotidjainak elkülönítése a fermentléből Adszorpció Amberlite XAD-2 gyantán: A körülbelül 12 liter térfogatú fermentlevet, mely 3 g inaktivált U-57 930 anyagot tartalmaz, 7, 7 pH értéken szűrési segédanyag alkalmazásával megszűrjük. A micéliumtömeget 1,2 liter vízzel megmossuk, és elvetjük. A tiszta szürletet egyesítjük a mosófolyadékkal, 6,0 pH-ra állítjuk és átfolyaljuk egy 600 ml Amberlite XAD-2-ből (Rohm and Haas Co., Philadelphia, PA) készített oszlopon, 40 ml/perc áramlási sebességgel. Az eltávozó folyadék biológiai aktivitását megvizsgáljuk alkálikus foszfatázzal való kezelés előtt és után, majd elvetjük. Az oszlopot 2 liter vízzel átmossuk. A vizes mosófolyadék alkálikus foszfatázzal való kezelés előtt és után biológiailag hatástalan, ezért elvetjük. Ezt követően az oszlopot metanol és víz 70:30 (térfogat/térfogat) arányú elegyével eluáljuk. Az eluálást 20 ml/perc sebességgel végezzük, és 20 ml térfogatú frakciókat fogunk fel. Az alkálikus foszfatázzal végzett kezelés előtti (—E) és utáni (+E) hatékonysági vizsgálat eredménye a következő: Zóna (S. lutea) (mm) A frakció sorszáma ~ TZ 5 0 0 10 0 0 11 0 0 13 0 36 20 33 55 25 32 54 40 31 50 45 29 48 50 26 39 55 23 38 60 21 37 65 19 27 70 17 26 75 17 26 80 16 26 85 16 26 90 16 26 95 15 26 100 16 26 110 16 21 120 16 21 130 15 21 140 15 21 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
