190949. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gonadotropin hormont felszabadító hormon antagonista peptidek előállítására
1 . 190 949 2 1. TÁBLÁZAT Sorszám R! R2 R* Rs r6 Rio í. P-D-2NAL 4-F-D-Phe D-Trp Ser [2-CH3-Phe D-Arg Gly-NH2 2. P-D-2NAL 4-F-D-Phe D-Trp Ser 3-CHj-Phe D-Arg Gly-NH2 3. P-D-2NAL 4-F-D-Phe D-Trp Ser 3-I-Tyr D-Arg Gly-NHj 4. dehidro-Pro 4-F-D-Phe D-Trp Ser 3-Cl-Phe D-Trp Gly-NH2 5. dehidro-Pro 4-F-D-Phe D-Trp Ser 2-F-Phe D-Trp Gly-NH2 6. dehidro-Pro 4-F-D-Phe • D-Trp Om 2-Cl-Phe D-Trp Gly-NH2 7. dehidro-Pro 4-F-D-Phe ß-D-2NAL Om Tyr ß-D-2NAL Gly-NH2 8. dehidro-Pro 4-Cl-D-Phe D-Trp Ser 2-CHj-Phe ß-D-INAL Gly-NH2 9. dehidro-Pro 4-F-D-Phe D-Trp Ser 2-Cl-Phe D-Trp Gly-NH2 10. dehidro-pro 4-F-D-Phe D-Trp Ser 3-F-Phe D-Trp Gly-NH2 11. ß-D-2-NAL 4-F-D-Phe D-Trp Ser 3-F-Phe D-Arg Gly-NH2 12. ß-D-2-NAL 4-F-D-Phe D-Trp Ser Tyr 4-gua-D-Phe Gly-NH2 13. ß-D-2-NAL 4-F-D-Phe D-Trp Ser Tyr D-His Gly-NH2 14. dehidro-Pro 4-F-D-Phe D-Trp AAL Tyr D-Leu NHCH3-CH3 15. D-Trp 4-F-D-Phe D-Trp aBu 2-F-Phe D-Phe NHCHj-CHj 16. D-p-GIu 4-F-D-Phe D-Trp Ser 2-F-Phe D-Ile D-Ala-NH2 17. D-Phe 4-F-D-Phe D-Trp Om 2-F-Phe D-Val Gly-NH2 BHA gyantát használunk, és a Boc-vel védett Gly:t a gyantához kapcsoljuk 2 órás időtartam alatt CH2Cl2-ben, háromszoros fölöslegben használva a Boc-származékot és DCC-t, mint aktiváló ágenst. A glicin-gyök a BHA-maradékhoz amidkötéssel kapcsolódik. Az egyes aminosav-gyökök kapcsolását követően mosást, védőcsoport-eltávolítást és a következő aminosav-gyök kapcsolását hajtjuk végre a II. táblázatban bemutatott munkamenet szerint, automatizált berendezés segítségével, mintegy 5 gramm gyantával kezdve. II. TÁBLÁZAT Lépés Reagensek és műveletek Keverési idő, perc 1. CH2C12 mosás - 80 ml (kétszer) 3 2. Metanol (MeOH) mosás - 30 ml (kétszer) 3 3. CH2C12 mosás - 80 ml (háromszor) 3 4. 50% TFA + 5% 1,2-etán-ditiol CH2Cl2-ben - 70 ml (kétszer) 10 5. Izopropil-alkohol, 1 % etán-ditiol mosás - 80 ml (kétszer) 3 6. 12,5% TEA CH2Cl2-ben - 70 ml (kétszer) 5 7. MeOH mosás - 40 ml (kétszer) 2 8. CH2CL2 mosás - 80 ml (háromszor) 3 9. Boc-aminosav (10 mmól) 30 ml oldószerben (vagy DMF-ben, vagy CH2Cl2-ben, a szóban forgó védett aminosav oldhatóságától függően) és DCC (10 mmól) CH2Cl2-ben (egyszer) 30-300 10. MeOH mosás - 40 ml (kétszer) 3 11. 12,5% TEA CH2Cl2-ben - 70 ml (egyszer) 3 12. MeOH mosás - 30 ml (kétszer) 3 13. CH2C12 mosás - 80 ml (kétszer) 3 A 13. lépés után alikvotot veszünk ki ninhidrines vizsgálathoz: ha a vizsgálat negatív, újra vissza lehet térni az 1. lépéshez a következő aminosav kapcsolása érdekében ; ha a vizsgálat pozitív, vissza kell lépni és megismételni á 9-13 lépéseket. A kapcsolás tehát kvantitatív mértékben végbemegy. A fenti munkamenetet használjuk a találmány szerinti peptid minden egyes aminosavának kapcsolásához, miután az első aminosavat megkötöttük. NaBoc védelmet használunk minden további aminosavhoz a szintézis során. Az NaBoc-ß-D- 25 2NAL-t a szakterületen ismert módon állítjuk elő, pl úgy, ahogyan ezt a 4 234 571 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás ismerteti (1980. november 18.). Az Arg oldallánc Tos-sal van védve. DBzl-t használunk a Ser hidroxil-csoportjá- 30 hoz oldallánc-védő csoportként. A D-Trp védetlen marad. NaBoc-ß-D-2NAL-t vezetünk be utolsó aminosavként. Á Boc-Arg(Tos)-t és Boc-D-Trp-t, amelyeknek oldhatósága CH2Cl2-ben kicsi, DMFCH2C12 keveréket használva kapcsoljuk. 35 Az a-amino-csoportot védő csoport eltávolítása után az N-terminális végnél, végrehajtjuk az ecetilezést, nagy fölöslegben használva ecetsav-anhidridet diklór-metánban. így a következő molekula képződik: Ac-ß-D-NAL-4 F-D-Phe-D-Trp-40 Ser(OBzl)-2 CH3-Phe-D-Arg(Tos)-Leu-Arg(TOS)Pro-Gly-NH-[gyanta]. A peptid Iehasítása a gyantáról és az oldalláncok védőcsoportjainak teljes felszámolása nagyon könnyen lezajlik 0 °C hőmérsékleten hidrogén-fluoriddal (HF). Anizolt is ada- 45 gólunk tisztító anyagként a HF kezelés előtt. Miután a HF-et vákuumban eltávolítottuk, a gyantát 50%-os ecetsavval extraháljuk és az extraktumot liofilizáljuk, a nyers terméket por formájában nyerjük. 50 A nyers peptid tisztítását azután ioncserélő kromatográfiával hajtjuk végre CMC-tölteten (Whatman CM 32, 0,05-0,3 mól NH4 OAc gradienst alkalmazva metanol-víz 1 : 1 keverékben), ezt követi a megoszlásos kromatográfia gél-szűrő oszlo- 55 pon, a következő eluciós rendszert használva : nbutanol-0,1 n ecetsav (1 : 1 - térfogat-arány). A peptid homogenitását vékonyréteg-kromatográfiát és több különböző oldószer-rendszert, valamint fordított fázisú nagynyomású folyadékg0 kromatográfiát és vizes trietil-ammónium-foszfát oldatot és acetonitrilt használva állapítjuk meg. Az így létrejött tisztított 1. peptid aminosav-analízise megegyezik az elkészített szerkezeti képlettel a lánc minden aminosavára nézve lényegében egész számú 65 értéket mutatva. 5
