190949. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gonadotropin hormont felszabadító hormon antagonista peptidek előállítására

1

190 949

2

A szintézis végén 3,5 g hordozógyantához kötött pepiidet kaptunk, a lehasitott nyers peptid súlya 1217 mg volt, amelyből tisztitás után 214 mg tiszta peptidet kaptunk.

A peptidet megvizsgáljuk in vitro és in vivo is. Az in vitro vizsgálatot elkülönített patkány hipofízis sejteket alkalmazva végezzük, amely sejteket tenyészetben tartottunk fenn 4 nappal a vizsgálat előtti időponttól. Az LH szintet, amely a peptidek alkalmazására válaszként jelentkezik, patkány LH-ra fajlagos radioimmunassay-vel méijük.

A kontroll sejtekhez csak 3 nanomól GnRH-t adunk, a kísérleti sejtekhez pedig 3 nanomól GnRH-t, ezen,kívül kapják vagy a jelen kísérletben standard antagonistának használt [Ac-dehidro- Pro1, 4-F-D-PHe2, D-Trp3,6]-GnRH vegyületet, vagy a vizsgálandó peptidet, 0,01-10 nanomól koncentráció-tartományban. A csak GnRH-val kezelt mintákban kiválasztott LH mennyiségét összehasonlítjuk azzal a mennyiséggel, amelyeket a pepiiddel és GnRH-val kezelt minták választanak ki.

A vizsgált pepiidnek azt a képességét, hogy csökkenti a 3 nanomól GnRH által kibocsátott LH mennyiségét, összehasonlítjuk a jelen kísérletben standardként használt peptid hasonló képességével. Az eredményeket minden egyes pepiidnél 3-5 adagot használva számítjuk ki, BIOPROG statisztikai program alapján (a programot D. Rodbard bocsátotta rendelkezésre) és a jelen kísérletben standardként használt pepiidhez viszonyított hatásként fejezzük ki. A jelen kísérletben standardként használt peptid általában a GnRH által kibocsátott LH 50%-át gátolja,^’* aránynál kisebb arányban alkalmazva.

A fentebb leírt peptidet használjuk a nőstény patkányok ovuláció gátló hatásának meghatározására is. Ebben a vizsgálatban meghatározott számú érett 225-250 g testsúlyú nőstény Sprague-Dawley patkányt injekciózunk 10 mikrogramm peptiddel (kukorica-olajban) a prooestrus napján déltájban. A prooestrus az oestrus (ovuláció) előtti délután. Egy külön nőstény patkány csoportot használunk kontrollként; amelyeknek nem adunk be peptidet. Mindegyik kontroll nőstény patkánynak van ovulációja az oestrusnál; a kezelt állatok közül egynek sincs ovulációja. Ennek eredményeképpen a peptidet szignifikánsan hatásosnak tekintjük a nőstény patkányok ovulációjának meggátlásában nagyon kis dózisoknál is, és a peptidet teljesen hatásosnak tekintjük 10 mikrogram körüli dózisnál. További vizsgálatokat is hajtottunk végre kis dózis szinten, amelynek eredményeit a III. táblázat mutatja be.

A 2-17. peptideket hasonló módon szintetizáljuk és tisztítjuk. Miután az aminosav analízis befejeződött, a tisztaságot HPLC-vel bizonyítjuk különböző oldószer-rendszereket használva. Az in vitro vizsgálatok hasonló módon végezve megmutatják, hogy néhány peptidnek van hatása a jelen kísérletben használt standard antagonistához hasonlítva. Az in vivo vizsgálatokat különböző dózisokkal hajtottuk végre más peptideknél, az eredményeket a

III. táblázat mutatja be.

III. TÁBLÁZAT

Peptid

száma

«

In vitro Hatás

Dózis (Mg)

in vivo Ovuláció

száma

í.-27,5

1

1/18

0,5

12/19

2.-29,4

1

6/18

3.-24,5

5

0/10

1

2/10

4.-74,9

1,02

10

9/10

5

3/10

5.-84,5

1,9

10

5

0/10

2/10

10

0/10

7.-77,5

0,29

2,5

1/10

1

8/10

9.-79,5

1,15

5

2,5

0/10

5/10

10.-73,1

0,45

10

5

0/6

2/20

11.-30,2

1

6/7

12.-36,6

2,5

8/10

13.-31,4

2,5

4/10

1

8/16

•[Ac-dehidro Pro1, 4-F-D-Phe2, D-Trpu]-GnRH-hoz viszonyítva.

**[a]” mérésének körülményei: C=l,50%-os vizes ecetsavoldatban

Az I. táblázatban felsorolt peptideket tekintjük hatásosnak a GnRH-indukált LH kiválasztás gátlásához in vitro ésszerű koncentrációk mellett. Ezek között a peptidek között több sokkal hatásosabb in vivo, mint a jelen kísérletben standardként használt peptid.

Ezeket a peptideket mind hatásosnak tekintjük a nőstény emlősök ovulációjának megakadályozására nagyon kis dózisoknál is, és közülük néhány kiválasztottat legalább kétszer olyan hatásosnak ítéljük, mint bármely eddig ismert és vizsgált GnRH-antagonistát.

A találmány szerinti peptideket adagolhatjuk gyógyászatilag elfogadható, nem toxikus sók formájában, ilyenek lehetnek savaddícíós sók, vagy fém-komplexek, pl. cink, bárium, kalcium, magnézium, aluminium vagy hasonló fémek komplexei (amelyek ilyen alkalmazás céljára megfelelő addíciós sóknak tekinthetők), vagy a kettő kombinációi. A savaddícíós sók képviselői lehetnek a hidroklorid, szulfát, foszfát, nitrát, oxalát, fumarát, glukonát, tannát, maleát, acetát, citrát, benzoát, szukcinát, alginát, malát, aszkorbát, tartarát és hasonlók. Ha az aktív hatóanyagot tabletta formájában adjuk be, a tabletta tartalmazhat gyógyászatilag elfogadható hígító anyagot is, amely magában foglalhat egy kötőanyagot, pl. tragakantot, kukoricakeményítőt vagy zselatint; egy málasztó ágenst, pl. alginsavat; és egy csúsztató anyagot, pl. magnézium-sztearátot. Ha a beadás folyadék formájában kívánatos, édesítő- és/vagy ízesitő-illatosító anyagokat is lehet használni a gyógyászatilag elfogadható hígítóanyag részeként; intravénás beadást pe-5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

6