190938. lajstromszámú szabadalom • Eljárás malária elleni gyógyszerkészítmények előállítására
3 190.938 4 Erba 3A 27B típusú aminosav-analizátorral végeztük, Móllá, P. módszere szerint (szakdoktori disszertáció, Marseille, 1975.). 5n sósavval végzett savas hidrolízis után kimutattunk: 5 bázisos aminosavat: gamma-amino-vajsav, ornitin, lizin, hisztidin, arginin, valamint 12 semleges aminosavat: aszparaginsav, treonin, szerin, prolin, glutaminsav, glicin, alanin, valin, izoleucin, leucin, tirozin, fenil-alanin. A kondenzált tanninok mennyiségét a kivonatban - ellentétben az elkülönített tiszta tannin meghatározásával - preparatív folyadékkromatográfiával határoztuk meg. A két alkalmazott eljárás, a Stiasny-reagensek használata és a 280 nm hullámhosszon végzett ultraibolya-spektroszkópiás módszer 60% ±3% értéket adott. A találmány szerinti készítmények maláriaellenes hatását Plasmodium berghei-vel fertőzött fehér egereken vizsgáltuk in vivo. A Plasmodium berghei az egérfélékben (Muridae) elsőnek felfedezett hematozoon. A legelterjedtebben használt laboratóriumi állatokban, így fehér egerekben és patkányokban, valamint hörcsögökben történő könnyű szaporítása és fenntartása miatt ez a parazita az új malárialienes szerek kutatásában kitűnően alkalmazható. Egy anyagnak akkor van in vivo maláriaellenes hatása, ha a parazitémiát csökkenti és egyidejűleg a kezelt egerek túlélési idejét is meghosszabbítja. Míg a szerzők nagy része a 4 napos vizsgálatot (4 days test) alkalmazza, amely az ED5(I és ED90 kutatását teszi lehetővé a fertőzött egerek 4 napos kezelésének végén, mi a kezelt egerek parazitémiájának kifejlődését elpusztulásukig, illetve esetleges gyógyulásukig kísértük figyelemmel. Ez a módszer, amelyet Peters alkalmazott a Plasmodium berghei Chloroquinnal szembeni rezisztenciájának vizsgálatakor, lehetővé teszi a parazitémia kifejlődése és a kezelt egerek túlélése közötti szoros kapcsolat megállapítását. 20 ±2 g-os fehér egereknek 0,05 ml, fertőzött vörcsvérsejteket tartalmazó vért adtunk be intraperitoncálisan. Ez2 • 107 parazitával fertőzött vörösvérsejtnek felel meg. 5 Minden egyes vizsgálati csoport 10 egérből állt, és minden egyes csoporthoz egy azonos létszámú kontrollcsoport tartozott. A termékeket steril desztillált vízben szuszpendáltuk és orálisan adagoltuk; az egerek kezelése a para- 10 zitával történő fertőzés napján kezdődött, és ezt 5 napon keresztül minden egyes egér esetében a napi dózis beadása követte. A keneteket a 3. vagy a 4. napon kezdtük vizsgálni. A vizsgálat végén meghatároztuk a parazitával fertőzött vörösvérsejtek százalékos ará- 15 nyát. Először a kinin-hidrokloridnak azt a minimális dózisát határoztuk meg, amely képes a parazitémiát csökkenteni, továbbá a kezelt egerek túlélését meghosszabbítja a kontrollcsoport állataihoz képest. 20 Ez a dózis 80 mg/kg körül van. A kinin-hidroklorid ebben az adagolásban csökkenti a parazitémiát a kezelés ideje alatt. A kezelt egerek kevéssel túlélték a kontrollállatokat. A kinin-hidrokloridot 120 és 150 mg/kg dózisban 25 adagolva a kezelt egerek parazitémiájának százalékos aránya csökkent. 30 napig végzett ellenőrzési periódus végén a túlélő egerekben nem mutattunk ki parazitákat. A cinkonin-hidroklorid 120 mg/kg-os dózisa 30 ugyanazt a hatást fejti ki, mint az azonos dózisban beadott kinin-hidroklorid. Megvizsgáltuk a találmány szerinti, vagyis kininhidrokloridot és tiszta tannint (100 mg/kg) tartalmazó két készítményt. A termékeket 120 mg/kg, il- 35 letve 150 mg/kg kinin-hidrokloridot és 100 mg/kg tannint tartalmazó készítmény alakjában adtuk be. Amint a találmány szerinti készítményekkel kezeltük az egereket, azok elhullási aránya (mortalitása) erősen csökkent. 40 A következő I. táblázatban bemutatjuk a találmány szerinti készítményekkel és a csak kinin-hidrokloriddal való kezelések összehasonlító adatait. (I. táblázat) A parazitémia %-os aránya a kezelt egereknél 10-es csoportok hllen— őrzési időpont Kinin-hidrokloríd (120 mg/kg) Kinin-hidroklo 'id (120 mg/kg) és tannin (100 mg/kg) Kinin-hidroklorid (150 mg/kg) Kinin-hidroklorid (150 mg/kg) és tannin (100 mg/kg) T„ + 3 nap 0, 5% 0. ,8% 0. ,1% 0 % • T0 + 7 nap 0 % 0 % 0 % 0 % T„ + 9 nap 0, 3% 0 0/ /o 0. ,1% 0 0/ /o T0 + 10 nap 1, 6% 1 % 0. ,4% 0 o/ /o T0 + 11 nap 9 0/ /o 1. ,5% 2 % 0 % T0 + 12 nap 28 o/ /o 3. ,5% 5. ,8% o,: 2% Tn + 14 nap 34 0/ /o 8 % 16 ,5% o,: 3% T(l + 15 nap 52 0/ /o 16. ,5% 24 o/ /o l,: 5% T„ + 16 nap 62 o/ /o 18 % 25 o/ /o 3,: 5% T„ + 17 nap 18. ,5% 19 o/ /o 7,: 5% T„ + 18 nap 19 O/ /o 16 O/ /0 11 % T„ + 21 nap 21 o/ /o 0 % 12 O/ /o T„ + 25 nap 12 % 0 % 8 0/ /o T0 + 26 nap 0 % 0 0/ /o 0 o/ /o T„ + 28 nap 0 o/ /o 0 o/ /o 0 % T0 + 30 nap 0 % 0 o/ /o 0 % A gyógyult állatok %-os aránya 0 o/ /o 30 % 30 o/ /o 50 %
