190938. lajstromszámú szabadalom • Eljárás malária elleni gyógyszerkészítmények előállítására
1 190.938 2 A találmány tárgya eljárás malária elleni gyógyszerkészítmények előállítására. A kinin maláriaellenes hatása közismert. Azt találtuk, hogy azok a gyógyszerkészítmények, amelyek a kinin és az Annona senegalensisből kivont tannin keverékét tartalmazzák, különösen hatásosak a malária ellen. A találmány szerinti gyógyszerkészítmények kinint tartalmaznak, adott esetben só formájában, az Annona senegalensisből kivont tiszta tanninnal vagy 60%-os tanninnal és adott esetben cinkoninnal összekeverve. A találmány szerinti gyógyszerkészítmények sokkal hatásosabbak, mint a kinin önmagában. A kínafa kérgéből kivont kinin és cinkonin az irodalomból maláriaellenes hatásukról ismertek. A cinkonin - mivel kissé toxikusabb, mint a kinin - a terápiában nem alkalmazható önmagában. A tiszta tannint és a 60%-os kondenzált tannint az Annona senegalensis törzsének kérgéből extraháljuk. A kivonat 60% kondenzált tannin mellett glükózt, aminosavakat és peptideket tartalmaz. A tiszta tannint preparatív folyadékkromatográfiás eljárással különítjük el, melynek során hordozóanyagként szilikagélt (RP 8 Merck), eluálószerként először desztillált vizet, majd 10% metanolt tartalmazó vizet és ezt követően 70% vizet tartalmazó metanolt használunk. A Stiasny-reagenssel mutatjuk ki a kondenzált tanninok egyedüli jelenlétét. Az Annona senegalensis tisztított kivonatát a következő módon állítjuk elő: Az Annona senegalensis törzsének szárított és porított kérgét ötszörös mennyiségű metanol-víz (55:45 súlyarányú) eleggyel lúgozzuk ki. A kapott folyadékból a metanolt csökkentett nyomás alatt elpárologtatjuk. A maradék vizes oldatot azonos mennyiségű etil-acetáttal kétszer extraháljuk. Az etil-acetátban oldódó frakciókat leöntjük. A maradék vizes fázisból a vizet finom porlasztással vagy liofilezéssel eltávolítjuk. A kapott maradékot melegen kétszer, súlyára vonatkoztatott tízszeres mennyiségű aceton-etil-acetát (1:1 térfogatarányú) eleggyel extraháljuk. Az etil-acetátban oldhatatlan anyagot vízben oldjuk, és a vizet finom porlasztással vagy liofilezéssel eltávolítjuk. A kapott Annona senegalensis-kivonat világosbarna por, amely igen jól oldódik vízben, részlegesen oldódik metanolban és etanolban, nem oldódik acetonban és éterben. A kivonatban lévő kondenzált tannint több vizsgálattal és reagenssel jellemeztük. 1. A kivonat néhány mg-ját 5 ml 5n sósavban forrásig melegítjük, intenzív vörös elszíneződés keletkezik. A lehűlés után oldhatatlan csapadékként flobafént kapunk. Ez a reakció a flavándiolokból származó kondenzált tanninok tulajdonsága. 2. 100 ml vízben oldott 100 mg kivonathoz hozzáadunk 50 ml Stiasny-reagenst (25 ml 40%-os formalin és 25 ml sósav) és így gesztenyeszínű csapadékot kapunk, ami a kondenzált tanninokra jellemző. 3. 0,5 ml 2%-os vas(III)-klorid-oldat hozzáadása 5 ml 0,5% kivonatot tartalmazó vizes oldathoz zöld elszíneződéshez vezet, ami a fenolok jelenlétére jellemző. 4. A kivonat 2%-os oldatából vett 2 ml-es mintához hozzáadunk 1 ml 0,ln kénsavat és 3 ml 10%-os vizes ammónium-molibdát-oldatot. Ez narancssárga elszíneződést eredményez, ami az orto-difenolok jellemzője. 5. 10 ml 5n sósavban feloldunk 0,2 g kivonatot, majd az oldatot 2 percig forró vízfürdőben tartjuk. Lehűlés után a keletkezett antocianidint 1 ml izoamil-alkohollal extraháljuk. Az antocianidint kromatográfiás eljárással azonosítottuk. Kivonat Kontroll cianidin Whatman-féle 1. sz papír Forestal-féle oldószer* R, = 0,17 Rr = 0,17 CCM-cellulóz, Merck HCOOH-HC1-FLO (10-1-3) R, = 0,42 R, = 0,42 CCM-cellulóz, Merck Amilalkohol-CH,COOH-H,0 (2-1-1) R, = 0,46 Rf = 0,46 *Forestal: ecetsav - tömény sósav - víz (5-3-10). Papírkromatográfiás eljárás után a foltokat Merck-gyártmányú metanollal eluáltuk. Spektroszkópiás vizsgálatnál a próba és a kontroll maximális abszorpciója egyaránt 537 nm-nél van. Ez a két próba lehetővé teszi a cianidin meghatározását a tannin (savas) hidrolízise után. 6. Vas(III)-klorid jelenlétében a kivonatot egyszerű, majd oxidációs hidrolízisnek vetjük alá, majd a vizes fázist nátrium-kloriddal telítjük és éterrel extraháljuk. A vas(III)-klorid 0,5%-os vizes oldatával rázott éteres fázis nem mutat galluszsavra jellemző kék elszíneződést, ami arra utal, hogy a kivonat nem tartalmaz gallusz-típusú hidrolizálható tanninokat. 7. Az alkaloidokra és szaponinokra irányuló vizsgálat negatív volt, ellentétben az irodalomban leírtakkal. 8. Ultraibolya-spektroszkópia: a 25 ug/ml arányban desztillált vízben oldott tiszta tannin abszorpciós maximuma 279-280 nm-nél mutatkozott. 280 nm-nél a DO értéke 0,30 és 0,33 közötti. A 25 ,«g/ml arányban desztillált vízben oldott 60%-os kivonat 279-280 nm-nél mutatott abszorpciós maximumot, a DO értéke pedig 0,18 és 0,20 között volt. A glükózt a glükóz-oxidáz sávok pozitív reakciójával és szilikagélen (GF 254 Merck) végzett vékonyréteg-kromatográfiával mutattuk ki. A futtatószer izopropanol - M/30 bórsav (85:15 térfogatarányú) elegy volt. A kimutatást anilin-ftalát porításával és 5 percig 105 °C-on, szárítószekrényben való hevítéssel végeztük. A vizsgálandó és a kontroll glükóz gesztenyeszínű foltot ad; az Rf megfelelő értéke 0,5 körül van. Az összes aminosav meghatározását egy Carlo-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
