190919. lajstromszámú szabadalom • Eljárás vírusok szaporitására alkalmas sejttenyészetek előállítására
3 190.919 4 CEO tenyészeten hasonló titerben, de sokkal egyszerűbben szaporítható. A Parvoviridae-csoportba tartozó canin parovírus (CP) MDCK, CRFK sejtvonalakon, Vero-sejteken, macskaembrióvese és kutyaembrióvese sejttenyésze- 5 tekben szaporítható (Eugster A. K. Am. J. Vet. Rés. Vol. 41. No. 12. 2020.). A CP vírus a bármely laboratóriumban is könnyen hozzáférhető, illetőleg előállítható CEO sejttenyészetben is jól szaporítható. A találmány szerinti eljárást a következő példák- 10 ban mutatjuk be közelebbről. 1. példa CEO sejttenyészet készítése A sejttenyészet készítéséhez 12 napig keltetett 15 SPF (Specific Pathogenic Free, azaz specifikus kórokozóktól mentes) csirkeembriókat használtunk. A tojáshéj fertőtlenítése után az embriókat kiszedtük a tojásokból és Petri-csészékben összegyűjtöttük. A csirkeembriók fejét a szemgolyók mögött átmetszettük. Az így levágott testrészeket (szemgolyó a szemhéjjal, alsó és felső csőr) steril Petri-csészékben 2 mm'-es darabkákra ollóval felaprítottuk. A vagdalék csak elvétve tartalmaz vörösvérsejteket, ezért a tripszines emésztés előtt mosást nem végeztünk. A szervvagdalék emésztését 0,1%-os tripszinnel végeztük. A 300-400 ezer sejt/ml sűrűségűre beállított sejtszuszpenzióból 200 ml-t mértünk kétliteres Roux-palackokba. A sejttenyészet 37 °C-on 48-72 óráig inkubálva egyenletesen benőtte az edények falát. A sejttenyészet tápfolyadékául 4% borjusavót, 3% triptózfoszfátot és 100 «g/ml gentamicint tartalmazó MEM-H oldatot használtunk. A tenyészetek felhasználása előtt a tápfolyadékot leöntöttük. Vírusfelvitel után a sejtkultúrák fenntartásához 2% borjúsavót, 3% triptózfoszfátot és 100 /<g/ml gentamicint tartalmazó MEM-H oldatot használtunk. 2. példa CEF és CEO összehasonlítása A kutyák szopornyicája elleni vakcinatermelésre használt avianizált (csirkeembrióhoz szoktatott) vírustörzseket általában csirkeembrió-fibroblaszt (CEF) sejttenyészetekben szaporítják (Paganini és Papparella: Acta Med. Vet. Napoli, 1960. 6. 253. - Lenkei: Állatgyógyászati Oltóanyagellenőrző Intézet évkönyve, Budapest, 1968-1972. 264. - Chappuis, Terré, Precausta, Mougeot, Moreau és Stellmann: Rév. de Med. Vet., 1973. - Vasic B., Vasic N., Lukic és Krstic: Vet. Clas. 1976. 6. 515.). Avianizált Lederle-féle szopornyica-vírustörzzsel CEF szövettenyészetben 10v’- TCID-n!/0.2 ml titerű, az 1. példa szerinti eljárással előállított CEO szövettenyészetben pedig Í04-l-u TCIDS(/0,2 ml titerű vírusanyagot nyertünk a törzsvírus 2. passzázsában. A vírust citopatogén hatása a CEO sejttenyészetben sokkal világosabb és kifejezettebb volt, ez a vírus aratása időpontjának könnyebb meghatározását és a vírusértékmérés sejttenyészetben való könnyebb kivitelezését nagymértékben elősegítette. A vírus elektronmikroszkóppal CEO sejttenyészetből nagyobb biztonsággal mutattuk ki, mint CEF tenyészetből. 3. példa A találmány szerinti eljárással készült sejttenyészetet 2,6 x 10s PFU/ml (plaque forming unit - plakkképző egység) titerű vaccinia-vírus (Poxivirus officinale) 5-szörös hígításaival oltottuk. A sejt-vírus 25 arány 1 sejt/0,481 vírusrészecske volt. A vírusfelviteltől számított 5. napon fagyasztással feltártuk a tenyészet sejtjeit és továbboltottuk a vírust. Mindegyik passzázsban naponta vettünk mintákat az oltott tenyészetek felülúszójából. Általában már a vírusfelvi- 30 tel 2-3. napján sejtlekerekedésben ésszövetfelszakadozásban megnyilvánuló CP (citopatogén) hatást észleltünk. A naponként vett mintákat a vírus titerének megállapítására 12 napos fiasított SPF tyúktojások cho- 35 rioallantois membránján titráltuk. A minták tízes alapú hígításainak 0,2 ml-eivel 5-5 db tojást oltottunk. A beoltott tojásokat 37,9°C-on tartottuk. Az oltást követően 48 óra múlva a hártyákat vaccinia-vírus jelenlétére megvizsgáltuk. A vírus tojáson mért 40 ínfektív dózisát a pozitív reakciókat összegezve Reed-Muench módszerével számítottuk ki. Pozitív standardként borjú bőrén termelt liofilizált vaccinavírust, negatív standardként pedig Koppenhágai HAVIG-himlő ellenes gamma-globulin 1:5 alaphígí- 45 tását használtuk. Az eredményeket az 1. táblázat mutatja. /. táblázat Standard és CEO sejttenyészetekben szaporított vaccinia-vírus (Poxvirus officinale) titerei Standard vírusok CEO sejttenyészetekben szaporított vírusok titerei PFU/ml titerei PFU/ml 1. passzázs 2. passzázs 3. passzázs 2,6 x 10s 1. nap 3,9-8,5 x 107 nem vizsg. nem vizsg. 2,1x10s 2. nap 9,2 xlO7 l,0x 108 2-3,1x10« 2,3 xlO8 3. nap 9,4 xlO7 l,3x 108 2,0x10s 4. nap 3,8 xlO5 2,9x107 nem vizsg. 5. nap 4,2 x10? 3,1 xlO7 nem vizsg. TCIDS(|: titsue cutlure infective doses 50%. Vírustitrálásnál ez az érték azt a vírushígítást jelenti, amelynél a tenyészetek 50%-ában van vírushatás. 3
