190919. lajstromszámú szabadalom • Eljárás vírusok szaporitására alkalmas sejttenyészetek előállítására
1 190.919 2 A találmány tárgya eljárás vírusok, különösen epitheliotróp (hámsejtkárosító, ill. hámsejtkedvelő) vírusok szaporítására alkalmas sejttenyészetek előállítására. A különböző sejttenyésztéssel foglalkozó intézetekben a CEF (chicken-embrio-fibroblast) sejtkultúrák készítése során vagy az egész csirkeembriófejet, vagy pedig a csirkeembriószemet eltávolítják, ill. szövettenyésztésre nem használják fel. Caswell S. Eidson virológus (University of Georgia, Experiment Station of Poultry Disease Research Center, Athens, Georgia) közlése (levél) szerint jobb CEF tenyészet készíthető, ha a csirkeembrió fejét nem használják fel. A csirkeembrió egyes szerveinek (agy, tüdő, vese, bőr, légcső stb.) kizárólagos felhasználásával készülő sejtkultúrák hazánkban is ismeretesek és az irodalomban is fellelhetők. (Margaret C. Wark, G. A. Tannock, D. Pye: Journal of Biological Standardization, 1979. 7. 73. - csirkeembrióvese -, G. Meulemans, P. Halen: Avian Pathology, 1978. 7. 433. - csirkeembrió-légcső és tüdő felhasználásával készítettek sejttenyészeteket.) A CEF sejttenyészetek készítése során a csirkeembrió szeme melléktermékként jelentkezik, illetve megsemmisítésre kerül. A találmány célja sejttenyészet előállítása az eddig haszontalan melléktermékként kidobott csirkeembriószem felhasználásával. A találmány alapja az a felismerés, hogy mivel a csirkeembriószem elsősorban hámtípusú sejteket tartalmaz (szemhéj-, kötőhártya-, szaruhártyasejtek), felhasználásával olyan sejttenyészet készíthető, amelyen sokféle vírus, elsősorban epitheliotróp vírusok jól szaporodnak. Szem eredetű sejttenyészeteket (humán kötőhártya, nyúl szaruhártya) a The American Type Culture Collection, Registry of Animal Cell Lines, Second Edition. 1972. helyen említenek, csirkeembriószemsejttenyészetről azonban nem tesznek említést. A találmány tárgya - a fentiek alapján - eljárás vírusok, elsősorban epitheliotróp vírusok szaporítására alkalmas sejttenyészetek előállítására. A találmány értelmében 10-15 napig keltetett SPF (Specific Pathogenic Free) csirkeembrió fejét a szemgolyók mögött átmetsszük, és az így levágott feji részeket - sejttenyészetek készítésénél szokásos technikával - felaprítjuk, tripszinnel emésztjük, borjúsavót és triptózfoszfátot tartalmazó tápközegben növesztjük. Kísérleteink során úgy találtuk, hogy a legelőnyösebb 12 napig keltetett csirkeembriót használni. A levágott feji részek vagdalékát a tripszines emésztés előtt nem szükséges mosni, mivel a vagdalék csak elvétve tartalmaz vörösvérsejteket. A szervvagdalék sejttenyészetté történő feldolgozását a sejttenyészet-készítésben szokásos technikák alkalmazásával végezzük. így az emésztést 0,1%-os tripszinnel végezzük, a sejttenyészet tápfolyadékául 4% borjúsavót, 3% triptózfoszfátot és 100 /zg/ml gentamicint tartalmazó MEM-H oldatot használunk, és a sejttenyészetet 37 °C-on 48-72 óra hosszat inkubálva növesztjük. MEM-H oldat összetétele: Sók: NaCl 8000 mg/1 KC1 400 mg/1 CaCl2 140 mg/1 MgS04 x 7 H,0 200 mg/1 K1LPO , 60 mg/1 Na2HP04x2H,0 60 mg/1 NaHCO, 350 mg/1 Glükóz: 1000 mg/1 Aminosavak: L-arginin x HC1 126 mg/1 L-cisztin 24 mg/1 L-glutamin 292 mg/1 L-hisztidin 42 mg/1 L-izoleucin 52,5 mg/1 L-leucin 52,4 mg/1 L-lizinxHCI 73 mg/I L-metionin 15 mg/1 L-fenilalanin 32 mg/1 L-treonin 48 mg/1 L-triptofán 10 mg/1 L-tirosin 36 mg/1 L-valin 46 mg/1 Vitaminok: Cholin-klorid 1 mg/1 Folsav 1 mg/1 i-lnositol 2 mg/1 Nikotinsavamid 1 mg/1 Pantoténsav Ca-só 1 mg/1 Piridoxál x HC1 1 mg/1 Riboflavin 0,1 l mg/1 Thiamin x HCl 1 mg/1 Fenolvörös: Az anyagokat kétszer desztillált vízben oldjuk. Az így készült sejttenyészetet CEO (Chicken Embryo Ocular) sejttenyészetnek neveztük el. Mivel a Pox- és a Parvo-csoportba tartozó vírusok hám-, illetőleg hámjellegű sejtekben szaporodnak elsősorban, a találmány szerinti eljárással készült sejttenyészet megfelelő alapot nyújt a szaporításukhoz. Természetes körülmények között a szopornyicavírus is megtámadja a hámsejteket (korábban keménytalpbetegségnek nevezték a kórképet a talp hámsejtjeinek túltengése miatt). Vizsgálataink alapján a találmány szerinti eljárással készült sejttenyészet alkalmasnak bizonyult egyéb épitheliotróp tulajdonságú vírusok (például Infectious-laryngo-tracheitis [fertőző gége-, légcsőgyulladás], (azaz ILT) és más sajátosságú vírusok (kacsapestis, kacsamájgyulladás, baromfipestis) szaporítására is. A találmány szerinti eljárással készült sejttenyészet még feltehetően sok más, általunk nem vizsgált vírus szaporítására is alkalmas. A CEO sejttenyészet nagy mennyiségben, gazdaságosan bármely sejttenyésztő laboratóriumban könnyen előállítható. Alapanyagként a CEF tenyészetek készítésekor melléktermékként fennmaradó és egyébként kidobásra kerülő csirkeembriófejeket használjuk fel. 1,5-2 db csirkeembriófejből egy Roux-palackra elegendő sejtszuszpenzió állítható elő. A Lederle-féle szopornyica-vírustörzs sejtkárosító hatása jobban megfigyelhető a CEO sejttenyészetben, mint a CEF tenyészetben. Ez a vírustörzs 0,8-1 hatványkitevővel magasabb titerben szaporítható CEO, mint CEF tenyészetekben. A humánhimlő (variola vaccae) vírusának szaporítása 3-5 hónapos borjak bőrébe való beoltással történik. Az oltás helyén keletkező duzzanatok gyűjtésével és feldolgozásával készül a vakcina, mely rendkívül munka-, anyag- és eszközigényes. A variolavírus 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
