190915. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új tripeptid-származékok előállítására
2. példa L-tirozil-D-alanil-N-etiI-N-(2-oxo-l-benzil-propil)-glicinamid-acetátsó előállítása A) 3-[N-(etiI-í-butiIoxi-karbamido)]-4-fenilbután-2-on 3.4 g (0,012 mól) N'‘-mzc-butiloxi-karbonil-N“-etil- L-fenilalanint oldunk 100 ml vízmentes éterben szobahőmérsékleten, nitrogén-atmoszférában. Az elegyhez ezután 14,4 ml (0,023 mól) 1,6 m metil-lítiumot adunk. Az elegyet szobahőmérsékleten 24 órát keverjük, majd 10 perc alatt 10 ml vizet adunk hozzá. A kapott szerves fázist elválasztjuk és 1,5 n citromsavval, majd vízzel mossuk. Azetiléteres oldatot vízmentes magnézium-szulfáton szárítjuk, majd csökkentett nyomáson bepárolva 2,6 g olajat kapunk. Az olajat diklórmetánban oldva Grace and Davidson 62 szilikagélt tartalmazó 10x2 cm-es oszlopra visszük. Az oszlopot diklórmetán- és kloroformlépcsős gradienssel eluáljuk (diklórmetán-diklórmetán:kloroform 50:50). A vékonyréteg-kromatográfiás profil alapján egyesítjük a frakciókat. Az oldószer bepárlása után 1,4 g (40%) címben szereplő vegyületet kapunk. NMR ó(Boc) 1,5; <3(-COCH,) 2,2; ó(fenil) 7,2. B) N''-rm>butiloxi-karbonil-D-alanil-N-etil-N-(2- oxo- l-benzil-propil)-glicinamid Az A) részből származó terméket (1,3 g, 4,5 mmól) oldunk 25 ml 1,0 n sósavgázt és 3,0 ml anizolt tartalmazó jégecetben. A keveréket szobahőmérsékleten keverjük 30 percig, majd etiléter és petroléter elegyére öntjük. A kapott csapadékot összegyűjtve és szárítva 1 g 3-etilamino-4-bután-2-on sósavas sót kapunk. Ezt az anyagot oldjuk 20 ml 1,19 g (4,5 mmól) N"-íerc-butiloxi-karbonil-D-alanil-glicint tartalmazó DMF-ben. Az elegyet 0 °C-ra hűtjük és 0,9 ml (4,5 mmól) diciklo-hexilamint, 0,61 mg (4,5 mmól) HBT-t és 0,93 mg (4,5 mmól) DCC-t adunk a reakcióelegyhez. Az elegyet 0 °C-on 6 órán át keverjük, majd szobahőmérsékleten 3 napig. Az elegyet ezután 0 °C-ra hűtjük, a csapadékot szűréssel eltávolítjuk, és s szűrletet csökkentett nyomáson bepároljuk. A kapott maradékot etilacetátban oldjuk, majd az etilacetátos oldatot egymás után extraháljuk 1 n nátrium-hidrogén-karbonáttal, vízzel, 1,5 n citromsavval és vízzel. A szerves fázist vízmentes magnézium-szulfáton szárítjuk, és csökkentett nyomáson bepárolva 1,3 g (69%) címben szereplő vegyületet kapunk szilárd anyag formában. C) Na-rm>butiloxi-karbonil-L-tirozil-D-alanil-N- etil-N-(2-oxo-l-benzil-propil)-glicinamid A B) pontból származó terméket (1,3 g; 3,1 mmól) 15 ml, 3 ml anizolt tartalmazó trifluorecetsavban oldjuk. Az elegyet 30 percig keverjük 0 °C-on. Az oldószert ezután csökkentett nyomáson, melegítés nélkül bepároljuk. A kapott olajat etiléterrel hígítjuk. A felülúszót dekantáljuk, és a kapott olajat csökkentett nyomáson szárítjuk. 871 mg (3,1 mmól) Na-íerc-butiloxi-karbonil-L-tirozint oldunk 10 ml DMF-ben, és az oldatot -15 °C- ra hűtjük. A kevert DMF oldathoz 0,34 ml (3,1 mmól) NMM-et és 0,41 ml (3,1 mmól) IBCF-et adunk. Az oldatot a további reakcióig -15 °C-on keverjük. A fentiekben készített trifluoracetát sót 5 ml DMF-ben oldjuk, és az oldatot -15 °C-ra hútjük. 9 6 0,34 ml (3,1 mmól) NMM-et adunk hozzá egy részletben, és az oldatot a reakció teljes lejátszódásáig keverjük. Ezt az oldatot adjuk az előzőleg elkészített, kevert anhidridhez. A kapott keveréket 4 óráig -15 °C-on, majd 24 óráig szobahőmérsékleten keverjük. Az elegyet 1 n vizes nátrium-hidrogén-karbonátoldatba öntjük, és a vizes oldatot etilacetáttal extraháljuk. A szerves fázist elválasztjuk, majd vízzel, 1,5 n citromsavval és újra vízzel extraháljuk. Az etilacetátos réteget vízmentes magnézium-szulfáton szárítjuk, és csökkentett nyomáson bepárolva 1,2 g (66%) címben szereplő vegyületet kapunk olaj formában. D) L-tirozil-D-alanil-N-etil-N-(2-oxo- 1-benzilpropil)-glicinamid-acetátsója A C) pontból származó terméket (1,2 g) 20 ml 3 ml, anizolt tartalmazó trifluorecetsavban oldjuk, és az elegyet 0 °C-on 30 percig keverjük. Az elegyet ezután liofilezzük. A kapott szilárd anyagot annyi pufferten (20% acetonitril, 0,1 m ammónium-acetát pFI 4,0) oldjuk, hogy 9,0 ml oldatot kapjunk. Az oldatot ugyanezzel a pufferral szuszpendált reverz fázisú szilikagélt tartalmazó 4x70 cm-es oszlopra visszük. Az eluátumot 280 nm-en ellenőrizzük, és a megfelelő frakciókat egyesítjük, majd liofilezve fehér, szilárd anyagot kapunk. A terméket 10 ml 0,2 m ecetsavban oldjuk, és az oldatot 2,5x90 cm-es Sephadex G-10 oszlopra visszük. Az oszlopot 0,2 m ecetsavval eluáljuk, és az eluátumot 280 nm-en ellenőrizzük. A megfelelő frakciókat egyesítjük, és liofilezve 509 mg (46%) címbeli vegyületet kapunk fehér, szilárd anyagként. [a]” + 28,3 (c = 0,5;MeOH) A C2(jH3sN407 (542,6) összegképlet alapján számított elemanalízis: számított: C = 61,98%, H = 7,06%, N = 10,33%; mért: C = 62,00%, H = 7,23%, N = 10,56%. Aminosav-elemzés: Tyr = 1,01, Alá = 1,01, Gly = 0,98, NH, = 0,12. A találmány szerinti vegyületek fájdalomcsillapító hatását az egérforró-lap teszttel mutatjuk ki. Ebben a vizsgálatban egy függőleges műanyag henger aljában egy 55 °C-on tartott forró lap található. Egy Harlan ND4 egérnek szubkután injekcióval előre meghatározott mennyiségű, megfelelő hordozóban oldott vagy szuszpendált tesztvegyületet adunk be, és 15 perccel a beadás után az egeret a forró lapra helyezzük. Azt az időt mérjük, ami az egérnek forró lapról való felugrásáig eltelik. Egy fájdalomcsillapító hatású vegyület megnöveli ezt az időtartamot a csak hordozót kapott kontroll egerekkel szemben. Ennek olyan dózistartományban kell megtörténnie, mely még nem okoz inkoordinációt vagy tehetetlenséget. A következő táblázat az ebből a tesztből származó ED50 értékeket mutatja be. Az „ED50” kifejezés azt a dózist jelenti, mely a vizsgált egerek 50%-ánál fájdalomcsillapító hatású. A fájdalomcsillapítást ügy határozzuk meg, mint azt a válaszbeli késést a vizsgált vegyület jelenlétében, mely egyenlő vagy nagyobb, mint a kontroll válasz-késés plusz két standard deviáció. A százalékos fájdalomcsillapítási adatokat probitokká alakítjuk, és az ED50-et a dózis-válasz adatok regressziós analízise alapján számoljuk ki. Miután a dózis-válasz görbének legalább négy pontot kell tartalmaznia, és mindegyik pontot minimum tíz kezelt egér és tíz kontroll egér adatai alapján határozzuk meg. 10 190.915 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
