190908. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán-humán hibridomák és ezek segítségével monoklonális antitestek előállítására
5 190.908 6 50 ml kecske-antihumán Ig-vel konjugált torma-peroxidázzal inkübátjuk további 30 percen át. A szűrőket ismét mossuk és inkubáljuk 150 ml orto-feniléndiamin (400 mg/ml) citrát-pufferes oldatával. Az egyes üregekből 100 ml-t viszünk át ezután egy új le- 5 mezre, amely 50 ml 2,5 mól/literes H2S04-et tartalmaz, és leolvassuk Dynatek (Alexandria, Virginia, Amerikai Egyesült Államok) MR 580 mikro-ELISA leolvasón 492 nm-nél. A hibridóma-tenyésztő folyadékot 50% ammó- 10 nium-szulfáttal kicsapjuk, és nyers Ig-frakciókat gyűjtünk össze. A csapadékokat fiziológiás sóoldatban feloldjuk és affinitás-kromatográfiával tisztítjuk, 5. aureus. Protein A-val kötött Sepharose-t alkalmazva IgG-vel és Sepharose-(birka-antihumán IgM- 15 antitest)-et alkalmazva IgM-mel. A CLNH 5 tápközeg-folyadékjának 1 literéből 2,2 mg IgM-met nyerünk, míg a CLNH 11 tápközeg-folyadékjának 1 literéből 3,0 g IgG-t nyerünk. Eredmények 20 Az 1. táblázat körvonalazza a fúzió eredményeit, amely megkísérli az anti-SCCC (méhnyakrák pikkelyes sejt) humán MoAb-k előállítását. A CLNH 5-öt és CLNH ll-et előállító fúzió (a CLNH 5 és CLNH 11 SCCC sejtvonalakkal reaktív monokloná- 25 lis IgMk antitesteket [MolgMk] és monoklonális FgG-antitesteket [MolgG] kiválasztó humán-humán hibridómák) 6, növekedésben pozitív üreget hoz létre a 80, lemezben elhelyezett üregből. A CLNH 5 és CLNH 11 hibridómákat klónozzuk és szaporítjuk, 30 ezután úgy találjuk, hogy ezek reagálnak a CaSki és Hela méhnyakrák-sejtvonalakkal. 1. táblázat Humán Mo Ab -K létrehozása és azonosítása 35 Sorvasztó 1 Fuzionált Létrehozott n^lr0, limfociták hidridómák Kiválasztás Humán M G A reaktivitás Méhnyakrák(SCCC) 7,0 • Kb 6 2 2(CLNH5 és 0 CLNHÍ1) 40 A felsorolt sejtvonalak mindegyikéhez kötött humán MoAb relatív mennyiségét EIA-val mérjük. A CLNH 5 által kiválasztott antitest (IgM) pozitív reaktivitást mutat a méhnyakrákkal (CaSki, Hela), nyelvrákkal (T 293, Calu-Í és SK-MES-1), melanó- 50 mával (SK-MEL-28) és prosztatarákkal (LnCap) és negatív normál fibroblasztokkal, T-limfocitákkal és perifériás vérlimfocitákkal. A CLNH 11 által kiválasztott antitest pozitív reaktivitást mutat a méhnyakrákkal (CaSki, Hela), prosztatarákkal, mellrákkal 55 (ZR-76-1), végbélrákkal (COLO-205) és melanómával (G-361), és negatív normál fibroblasztokkal (WI- 38 és MRC-9), T-limfocitákkal és perifériás vérlimfocitákkal. A jelen találmány szerinti hibridómák sejtbioké- 60 miai tulajdonságait az alábbiakban mutatjuk be: CLNH 5-hibridóma: -(1) Kromoszómák száma: 60-90 (maximális gyakoriság 80); (2) Humán immunglobulin M-et (IgM) választ ki; 55 (3) Kettőződési idő: 30-40 óra; (4) Limfocita jellegű egyedi sejt; (5) DNS-tartalma legalább kétszerese, leginkább 2-2,5-szöröse a normál humán limfociták DNS-tartalmának; (6) Az IgM kötődik az emberi méhnyakrák-sejtekhez és más, fentebb említett karcinómákhoz. A fent említett CLNH 5 ezenfelül szaporodik HAT tápközegben (hipotoxint, amenopterint és timidint tartalmazó tápközeg). CLNH 11 hibridóma: -(1) Kromoszómák száma: 60-90 (maximális gyakoriság: 80); (2) Humán immunglobulin G-t (IgG) választ ki; (3) Kettőződési idő: 30-40 óra; (4) Limfocita jellegű egyedi sejt; (5) DNS-tartalma legalább kétszerese, leginkább 2-2,5-szöröse a normál humán limfociták DNS-tartalmának; (6) Az IgG kötődik az emberi méhnyakrák-sejtekhez és más, fentebb említett karcinómákhoz. A fent említett CLNH 11 ezenfelül szaporodik HAT-tápközegben. A relatív DNS-tartalmat-(a normál humán limfocita DNS-tartalmához mért arányt) egy olyan módszerrel határoztuk meg, amely magába foglalja a hibridóma festését, majd elkülönítését és elemzését citofhiorométer segítségével. A monoklonális humán immunglobulinok tulajdonságait ezzel a találmánnyal összhangban mutatjuk be. CLNH 5 hibridóma által előállított monoklonális humán immunglobulin (a) Ez humán immunglobulin M (IgM); (b) Ennek a kötőaffinitása erősebb a Hela és a Ski sejt von alakhoz, mint a normál fibroblasztoké (WI-38); (c) Ez nem reagál humán vörösvérsejtekkel, sem nem mutat agglutinációs reakciót humán vörösvérsejteken; (d) Ez nehéz láncokból (H-láncok) és könnyű láncokból (L-láncok) van összeállítva, molekulasúly 180 000 (monomer), és mint pentamer van jelen a tenyésztő folyadékban. CLNH 11 hibridóma által előállított monoklonális humán immunglobulin (a) Ez humán immunglobulin G; (b) Ennek kötőaktivitása erősebb a Hela és CaSki sejtvonalakhoz, mint a normál fíbroblasztoké; (c) Ez nem reagál humán vörösvérsejtekkel, sem nem mutat agglutinációs reakciót humán vörösvérsej teken; (d) Ez H-láncokból és L-láncokból van összeállítva, és molekulasúlya mintegy 150 000. A humán monoklonális antitestek kötőaktivitását, amely különböző a neoplasztikus sejtekhez és a normál sejtekhez, a következőképpen mérjük: Egy eredeti emberi szövetmetszetet, amely tartalmaz normál sejtet is és rákos sejtet is, rögzítünk üveglemezen glutáraldehiddel, majd enzim-immunassay-val megfestjük Steinberger és munkatársai módszere szerint (J. Hist. Cyto. 18, 315 [1970]). A szóban forgó monoklonális antitestek felhasználhatók a méhnyakrák, valamint más reaktív tumo-4
