190908. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán-humán hibridomák és ezek segítségével monoklonális antitestek előállítására
3 190.908 4 mintegy 105 sejt/üreg koncentrációban, és megfelelő időt hagyunk a sejtek kinövéséhez. A szelektív tápközeget időről időre lecseréljük. A fenti fúzióból Tiyert üregek a gazdabeteg méhnyakrák-sejtjeivel fajlagosan reaktív kiónokat szolgáltatnak, ezeket jelöljük CLNH 5-nek és CLNH 11-nek. Ezek az üregek humán IgM, illetve IgG monoklonális humán antitesteket szolgáltatnak, amelyek reagálnak a méhnyakrák és más tumorsejtvonalak széles változatosságban található antigénekkel, pl. a nyelv kissejtes karcinómájával; ugyanakkor nem reagálnak a vizsgált normál szövetekkel és normál sejtvonalakkal. A hibridómák és a monoklonális antitestek széles körű felhasználást nyernek főleg mint genetikai anyag forrásai, mint reagensek és mint prekurzorok olyan termékekhez, amelyek azután reagensként nyernek alkalmazást. A szóban forgó hibridómákat genetikai anyag forrásaként lehet használni. így pl. a szóban forgó hibridómákat fuzionálni lehet más fúziós partnerekkel, hogy olyan új hibridómákat nyerünk, amelyek ugyanolyan kiválasztási (szekréciós) képességgel rendelkeznek, mint a CLNH 5 és CLNH 11, és azonos fajlagosságú antitesteket állítanak elő. Az ilyen fúzió eredménye különböző „nehéz” láncokkal bíró antitestek képzésében jelentkezik, vagyis más osztályokba vagy alosztályokba (pl. G, A vagy M) tartozó antitestek szolgáltatásában. A hibridómát lehet használni DNS forrásaként is, amelyből hibrid DNS-technológiával a géneket ki lehet metszeni és limfómába bevezetni érett antitestek képzése érdekében. A monoklonális antitesteket széles területen lehet alkalmazni mind in vivo, mind in vitro diagnózisban, valamint a terápiában is. Több alkalmazás esetében az antitesteket jelezni lehet valamilyen vegyülettel, amely valamilyen kívánt tulajdonságot juttat az antitesthez, mint pl. egy kimutatható jelzést, citotoxicitást, lokalizált elektromágneses sugárzást, vagy hasonlókat. A jelzések lehetnek radionuklidok, enzimek, fluorescens-anyagok, toxinok vagy toxinok citotoxikus fragmensei, részecskék, fémek, fémtulajdonságú anyagok stb. Az antitesteket be lehet építeni liposzóma membránokba vagy módosítani lipidekkel, hogy azok beépüljenek az ilyen membránokba. Az antitesteket vagy jelzett formájukat lehet használni az in vitro diagnózisban, pl. a neoplazmákkal (pl. méhnyakrákkal) kapcsolt antigének jelenlétének mérésére, in vivo diagnózisban egy gazdaszervezetbe bevezetve, pl. intravénásán egy fiziológiailag elfogadható hordozóban, mint pl. PBS-ben, és terápiás célokra, az előzőekben említett módon a szervezetbe juttatva. Az antitesteket vagy jelzett formájukat lehet alkalmazni többféle neoplazma kezeléséhez emberi gazdaszervezetben, így pl. méhnyakrákhoz, prosztatatumorhoz, végbélrákhoz, nyelvrákhoz, mellrákhoz és melanomához. A találmány szerinti antitestek könnyen oldódnak fiziológiás sóoldatban, és ezért sóoldat vagy csepp formájában intravénásán vagy intramuszkulárisan injektálhatok. Ezenfelül a találmány szerinti antitesteket lehet használni kenőcs vagy kúp formájában is. Az alkalmazott antitest mennyisége változik a szóban forgó alkalmazási területtől függően. Az antitestek bevezetését diagnosztikai és terápiás célokra kiterjedten leírja az irodalom. A teljes antitest alkalmazására nincs mindig szükség, több alkalmazáshoz egy érintetlen, változó területekkel bíró fragmens is elegendő. így pl. Fab-fragmensek, F(ab’)2-fragmensek vagy Fv-fragmensek is elegendők lehetnek. Az ezután következő kiviteli példák csak a bemutatás célját szolgálják, és nem korlátozó jellegűek. A hibridómák egyesítése és kiválasztása Nyirokcsomókat vagdosunk össze csipesszel RPMI 1640 tápközegben, és izolált limfocitákat tenyésztünk egy éjszakán át 37 °C hőmérsékleten 5% C02 jelenlétében RPMI 160 tápközegben, amely 10% borjúembrió-szérumot (FCS) és 2 mmól/liter L- glutamint is tartalmaz. A limfocitákat megszámoljuk, és 2:1 arányban UC 729-6 humán limfoblasztoid B sejtvonallal keverjük össze (Handley és R’oyston, 1982: Hybridomas in Cancer Diagnosis and Treatment 125-322. Kiadó: Mitchell és Oettgen; Raven Press, New York), majd egyesítjük polietilénglikol 1500-zal, Gefter és munkatársainak (Somatic Cell Genetics (1977) 3: 321-336.) némileg módosított módszerével. Az egyesített sejteket 105 sejt/üreg mennyiségben lemezre visszük, mégpedig Costar üreges mikrotitráló lemezre hipoxantin-ametopterin-timidin (HAT, lásd Littlefield, Science [1964] 145: 709-710.) tápközeggel, amely ki van egészítve 10% FCS-t és L-glutamint is tartalmazó RPMI 1640 tápközeggel. 10-20 napon belül a hibridóma-növekedésre pozitív üregeket megmérjük humán antitesttermelésre és azok reaktivitására egy korlátozott humán sejtmezőhöz enzim immunoassay (EIA) segítségével. A reaktivitás szempontjából pozitív üregeket klónozzulckorlátozott hígítással, a betápláló réteg alkalmazása nélkül, és szaporítjuk a további tanulmányokhoz. Enzim immunoassay Humán monoklonális antitesteket (továbbiakban MoAb) és sejtekhez való reaktivitásukat egy korábban leírt EIA módosításával határoztuk meg (Handley és munkatársai: J. of Immunologic Methods [1982] 54: 291-296, és ennek módosítása Glassy és munkatársai szerint: J. of Immunologic Methods [1983] , nyomtatás alatt). Röviden: milliliterenként vagy 50 ml affinitással -tisztított kecske-antihumán Ig-t vagy 4 • 106 célsejtet tartalmazó szuszpenziót immobilizálunk egy immunszűrő-sokszorozó hármas üregeiben. (A speciálisan tervezett mikrotitráló lemez, amely mind az inkubációs kamrához, mind a szűrősokszorozóhoz szolgálhat, a Vand P. Scientific cég VP 107 jelű gyártmánya (San Diego, Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok). Minden egyes üreg feneke egy 0,6 mm-es lyukat tartalmaz, amely fölé egy 6 mm átmérőjű üvegrost szűrő van helyezve. A felületi feszültség megakadályozza, hogy a kevesebb mint 100 ml-nyi folyadékmennyiségek átszívódjanák a lyukon, amíg vákuumot nem alkalmazunk. Amikor vákuumot alkalmazunk, a folyadék átszívódik a leszívó lyukon, a szemcsés anyagokat a szűrőn, mint csapdán otthagyva. Háromszoros mosás után 0,3% zselatint tartalmazó, foszfáttal pufferolt sóoldattal 50 ml hibridóma felülúszót ínkubalunk 30 percen át szobahőmérsékleten. Ezután a szűrőket mossuk és 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
