190908. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán-humán hibridomák és ezek segítségével monoklonális antitestek előállítására
Az emlős immunrendszernek egyedülálló képessége , hogy bizonyos térbeli és poláris szerkezethez való fajlagossággal és vonzódással bíró molekulákat hoz létre, amint ezaz-aminosav- és cukorszekvenciákban megtalálható. Hosszú ideig az antitestek termelése az immunrendszer in vivo alkalmazásától függött. Az így létrejött poliklonális antitestek nagy fajlagosságot mutattak a fajlagos antigénre, de nem tudtak különbséget tenni az antigén különböző helyei között, sőt ezek különböző fajlagosságú és vonzódású antitestek keverékéi voltak. Ilyen formában a teljes keverék átlagát lehetett megfigyelni, és nem egy fajlagos antitest tulajdonságait. Milstein és Kohler jelentős felfedezésével lehetővé vált -antitesték homogén összetételét létrehozni B- limfecita-összekapcsolásával, mielómasejttel, ilyen módon olyan sejtet alakítva ki, amelyet hibridómának neveztek el. Legtöbb esetben az ilyen technológiák használata egérsejtekre korlátozódott, ahol stabil mielómavonal szolgált fúziós partnerként, olyan stabil híbridómákat szolgáltatva, amelyeket nagy hatásfokkal lehet előállítani, és amelyek képesek fenntartani termelő tulajdonságaikat hosszú időn át. Magasabb rendű szervezetek, elsősorban emberi szervezetek sokkal irányíthatatlanabbaknak bizonyultak fúziós partnerek és hibridómák kifejlesztésében. 1980-ban azonban dr. Olsson és dr. Kaplan beszámoltak az első emberi fúziós partnerről, és azóta már néhány újabb emberi fúziós partnert ismertettek. Mindazonáltal a humán-humán keresztezéses hibrídómák készítése nehéz maradt a fúzióban, a sejtek tenyésztésében és termelőképességük fenntartásában jelentkező hatásossági problémák miatt. A humán hibridómák számtalan előnye miatt azonban, amelyek allogén antitesteket állítanak elő az emberi gazdaszervezethez, főleg in vivő alkalmazásához, a humán hibridómák iránti érdeklődés fennmaradt. Más esetekben még a humán-humán keresztezésnél fellépő nehézségekkel együtt is lehet előnyös a humán hibridóma a heterogén keresztezésekhez, ahol a keletkezett hibridóma elvesztheti a monoklonális antitesthez szolgáló genetikai információt néhány paszszálás után. A monoklonális antitestek felhasználásának egyik érdeklődésre számot tartó területe a rák diagnosztizálása és kezelése. Az ilyen célra szolgáló antitestek kívánatos, hogy fajlagosak legyenek egy bizonyos típusú rákra vagy rákcsoportra, inkább, minthogy fajlagos legyen a szóban forgó rákgazda sejtjeire. Ezért kívánatos kifejezni monoklonális antitesteket, amelyeket fel lehet használni az emberi rák diagnózisában és kezelésében. Nowinski és munkatársai (Science [1980] 210:537- 539) írnak le humán monoklonális antitesteket Forssmann antigén ellen. Corce és munkatársai (Nature [1980] 288: 488-489) írnak le olyan humán hibridómákat, amelyek antitesteket választanak ki kanyaróvírus ellen. Olsson és Kaplan (PNAS USA [1980] 77: 5429-5431) olyan humán-humán híbridómákat írnak le, amelyek előre meghatározott antigén-fajlagosságú monoklonális antitesteket termelnek, valamint. az ilyen antitestek termeléséhez alkalmazott fúziós partnert. (Lásd még az ezzel összefüggő amerikai egyesült államokbeli 247 652. sz. bejelentést, iktatva; 1981. márc. 26.) 1 1 2 Schlom (PNAS USA [1980] 77; 6841-6845) ír le monoklonális antitesteket mellrákhoz, és Sikora {Brit J. of Cancer \ 1981] 43:696) ír le a rákból in situ szeparált limfocitákat, amelyek rákra fajlagos antitesteket szolgáltattak. A Proceedings of the 15th Leukocyte Culture Conference-ben (szerkesztők: Parker és O’Brien, kiadó; Wiley Interscierrce, New York) (1982. dec. 5-10.) a szóban forgó hibridómát írták le. Ez a kivonat itt is be van építve az irodalmi hivatkozások között. A továbbiakban a találmány egy előnyős kiviteli módját írjuk le. Szilárd tumorokból nyert, neoplasztikus sejtekre fajlagos humán monoklonális antitesteket nyerünk humán-humán fúzió segítségével, B-limfocitákat alkalmazva, pl. szilárd tumort elsorvasztó nyirokcsomókból. Főleg olyan nyirokcsomókat választunk ki, amelyek aktívnak tűnnek a nyirokcsomó szomszédságában levő tumorsejtek elhalása alapján egy immunkompetens gazdaszervezetben. Az elsorvasztó nyirokcsomó(k) izolálható(k) a humán szövetek széles választékával együtt, pl. méhnyak, emlő, végbél, nyelv, prosztata, bőr stb. A legérdekesebbek a gerincvelő-területről származó nyirokcsomók. A fúziós partner lehet bármilyen alkalmas továbbélővé tett (immortalizált) B-sejt, amely nem választ ki immunglobulinokat, vagy annak egyedi láncait vagy fragmenseit, lehet szelektálni, mint pl. HAT- tápközeggel, és fúziós hatékonysága célszerűen nagy. Ilyen partnerek lehetnek pl. UC 729-6, J-4 (SKO-007) és GM 1500 6TG-A 12. A fúziót az irodalomban leírt módszerrel hajthatjuk végre, fuzogénként PEG 1500-at alkalmazva, a sejteket HAT-tápközegben lemezre téve az üregek többségében és azután az élő sejtüregekben levő felülúszókat a szóban forgó antitestekre szűrővizsgálatnak vetve alá. A reaktivitás szempontjából pozitív üregeket azután klónozzuk korlátozott hígításos módszerrel és szaporítjuk. Különösebben érdekesek az új CLNH 5 és CLNH 11 hibridómák, a CLNH 5-ből és CLNH 11- ből nyert hibridómák, az ilyen hibridómákból származó antitestek, az ilyen antitestek származékai és az antitesteknek és származékaiknak alkalmazása diagnózishoz és terápiához. A CLNH 5-ötésaCLNH 11-etazUC 729-6 fúziós partner és egy méhnyakrákban szenvedő beteg nyirokcsomósejtjeiből nyert limfociták közötti fúzióval nyerjük. Az UC 729-6 az ATCC-nál letétbe van helyezve CRL 8061 beszerzési számon. Az UC 729-6 szabadalmi céllal van elhelyezve a 247 652. iktatószámú amerikai egyesült államokbeli bejelentéssel kapcsolatban. A fúzióhoz alkalmazott limfociták: egy sorvasztó nyirokcsomó a gerincvelő-területről és perifériás vérlimfociták egy méhnyakrákban szenvedő betegből. A fúziót úgy hajtjuk végre, hogy a beteg nyirokmirigyből származó limfocitáit kombináljuk az UC 729- 6 fúziós partnerral 2:1 arányban, egy HEPES-ben pufferolt RPMI 1640 tápközegben 35% polietilénglikollal kialakított oldatban. A sejtek keverékét azután szuszpendáljuk a megfelelő szelektív tápközegben, elsősorban HAT-tápközegben, amely 10% borjúembrió-szérumot tartalmaz, üregekbe helyezzük 2 90.908 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
