190893. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fogszuvasodást gátló, fehérje jellegű antigén preparátumik előállítására
7 A fenti eljárással olyan antigén A és B fehérje preparátumot kapunk, melyek NDS-poliakrilamid gélelektroforézissel és poliakrilamid gélen végrehajtott izoelektromos elválasztással tisztának bizonyultak. Ha ezeket a preparátumokat adjuvánsokkal együtt nyulakba fecskendezzük, az NDS-sel extrahált sejtekkel fentebb leírt immunizálási módszert követve, monospecifikus antiszérum termelődik, melynek hatását gélen való lecsapásos módszerrel nyers antigén készítményeken vizsgálva csak a homológ antigén csapódik ki. Az antigén A-val és B-vel szemben termelődött monospecifikus antiszérumokat felhasználhatjuk az antigének immunoszorbciós affinitás-kromatográfiás tisztítására. Egy tipikus eljárás szerint a szérum immunoglobulin G frakcióját térhálósított agaróz gyöngyökhöz kapcsoljuk (brómciánnal aktivált Sepharose, Pharmacia) a gyártó által javasolt módon. Az oszlopon az Ingbritt-féle Streptococcus mutáns törzs tenyészetének töményített szűrletét engedjük át, 0,05 M-os 7,5 pH-jú trisz sósav pufferben, mely 1% Triton X-100-at tartalmaz. Ezután az oszlopot néhány térfogat trisz pufferrel mossuk, majd 3M nátrium-tiocianátot tartalmazó trisz pufferrel vagy 2,8 pH-jú 0,1 M glicint tartalmazó sósav pufferrel eluáljuk (más eluálószerek is megfelelőek lehetnek.) így a kívánt antigének tiszta készítményeit kapjuk. Ha az oszlopról az IgG egy része is eluálódna, ez könnyen elválasztható az antigénektől a már leírt ioncserélő kromatográfiás módszerrel. Az affinitás-kromatográfiás módszerrel tisztított antigént 48 óráig 105 °C hőmérsékleten 6N sósavban hidrolizáltuk és meghatároztuk aminosav-összetételét. Az eredményeket az 1. táblázatban tüntettük fel. 1. táblázat Fehérjehidrolizátumok aminosav összetétele Az egyes aminosavgyökök száma(%o) antigén A antigén B Aszparaginsav 101 103 Treonin 56 60 Szerin 91 61 Clutaminsav 106 111 Prolin 65 44 Clicin 190 212 Alanin 89 117 CisztinValin 53 58 MetioninIzoleucin 38 38 Leucin 61 53 Fenilalanin 28 25 Tirozin— Hisztidin 50 18 Lizin 46 64 Arginin 27 26 Aminocukor-4 4. példa Az antigén és védőhatás vizsgálata Az antigén A és B kijutnak a baktériumok felszínére és immunogénekként hatnak. Az olyan kísérletek, melyeket néhány tucat nyúl és majom immunizálásával hajtottak végre, megmutatták, hogy az antigén A és B által kiváltott antitest válaszok sokkal erő-8 sebbek, mint a más antigének által kiváltottak. Az a hatás még erősebb akkor, ha az állatokat sejtfalban gazdag készítménnyel immunizálják. Mint fentebb leírtuk, az NDS-sel extrahált sejtfalak hatására csak az antigén A és B antitestjei képződnek, míg a kevésbé szelektív extrakciónak alávetett sejtfalak hatására szintén az antigén A és B antitestjeinek képződése a legintenzívebb, de két másik jelenlevő antigén is kivált - gyengébb - immunválaszt. Az antitestek a szokásos módszerekkel, például térhálósított anyagon végrehajtott immunoelektroforézissel vagy „reversed-rocket line" elektroforézissel mutathatók ki. Az antitest válasz erőssége meghatározható enzimes immunoszorbens vizsgálattal (ELISA), Voller, Bidwell és Bartlett mikrolemezes módszere szerint (Flowline Publications, 1977). Műanyagból készült Microtiter tálcákat az immunoaffinitásos módszerrel tisztított antigén A-t és B-t körülbelül 1 ug/ml koncentrációban tartalmazó anyaggal vontuk be. Az antigénen megkötődött majom antitest menynyiségét úgy határoztuk meg, hogy alkáli-foszfatázhoz kapcsolt emberi anti-IgG-vel (Don Whitley Ltd. ) inkubáltuk. Az eredményeket vagy úgy fejeztük ki, mint egy titrálás végpontjának értékét (azaz egy hígítás! sorozatnak az a tagja, mely egy bizonyos színt mutat), vagy pedig egy bizonyos hígítású szérum minta 405 nm-nél mutatott abszorbanciájának megmérésével. 5. példa A teljes sejtek immunogenitása Fentebb már említettünk leírásokat, melyek majmok sikeres immunizálásáról számolnak be Streptococcus mutáns teljes sejtjeivel (Bowen és munkatársai: Brit. Dent. J, (1975), és Cohen és munkatársai: Brit. Dent. J. [1979]). A fogszuvasodás csökkenésének mértéke 50%-os vagy még jobb volt. Az egyik kísérlet során 4 kísérleti és 2 kontroll állatot kezeltek megölt teljes sejtekkel (Cohen és munkatársai: Brit. Dent. J., 147, 9-14 [1979] 14-es állatcsoport). Az injekciókat a nulladik, második, ötödik, hatodik, tizenkettedik és tizennyolcadik hónapban adták. Az átlagos antitest (IgG) színt a kísérleti és a kontroll csoportban az 1. ábrán látható. Tizenkét hónap után az antigén A-val szemben termelt antitest szintje legalább harmincszorosa volt a kontroliénak, bár ezt a szintet két injekció közti időben mértük. Hangsúlyozni kell, hogy valószínűtlen, hogy ilyen sok injekció kell a védettség eléréséhez, de ebben az irányban még nem folytak kutatások. Négy évvel a kísérlet megkezdése után a kontrollcsoport állatainak átlagban 5 maradandó foguk volt szuvas, míg az immunizált állatoknak általában kettő. Az eredményekből látható, hogy nyilvánvaló összefüggés van az antigén A antitestjeinek szintje és a fogszuvasodás elleni védelem között. Nem immunizált egyedekben az antigén A antitestjei csak ritkán és kis mennyiségben vannak jelen. Ilyen „természetes antitestje” az antigén B-nek is van és azt néhány esetben kimutatták. Nem ismeretes, hogy ezek az antitestek mikor keletkeznek, hogy a fogakon levő Streptococcus mutáns antigénje hatására jönnek-e létre, szisztemikus Streptococcus mutáns fertőzés 5 190.893 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
