190893. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fogszuvasodást gátló, fehérje jellegű antigén preparátumik előállítására
9 190.893 10 eredményezi-e vagy más baktériumok antigénjeivel való keresztreaktivitás révén képződnek-e, mely baktériumokkal szemben az állatnak van immunválasza. Egy másik kísérletben egy nyolc majomból álló csoportot immunizáltak a lábszárba adott, teljes sejteket és alumínium-hidroxid adjuvánst tartalmazó szubkután injekcióval (Cohen és munkatársai: Brit. Dent. J., az ezen példában már hivatkozott cikk szerinti 11. csoport), a kontrollcsoport is 8 állatból állt. Ebben az állatcsoportban az antigén A antitestjeinek szintje az összes kontrollállatban emelkedett, az átlagos titer 1/520 volt. (Megjegyezzük, hogy az eljárás változtatása miatt a különböző csoportoknál kapott literek nem hasonlíthatók össze.) A teljes baktériumsejtekkel immunizált állatoknál az átlagos titer hat hónappal az injekció után 1/2830 volt - kontroliénak csaknem ötszöröse. Az immunizált állatokban az antigén B antitestjei is jelen voltak. A kontrolihoz képest az immunizált állatoknál a fogszuvasodás 55%-os csökkenését észlelték. 6. példa Az elválasztott sejtfalak immanogenitása A korábban leírt immunizálás az Ingbritt-törzs különválasztott sejtfalaival (Bowen és munkatársai: Brit. Dent. J.. 45-48, [1975]) védettséget biztosított ennek a törzsnek az újabb fertőzése ellen. A tripszinnel kezelt sejtfalakkal végrehajtott immunizálás nem eredményezett védettséget, ami azt bizonyítja, hogy a védekezés kiváltásában fehérjetermészetű anyag játszik szerepet. Szérumot vettek 4, az Ingbritt-féle törzs sejtfalpreparátumával immunizált, majd ugyanezzel a törzzsel fertőzött C csoportba tartozó majomtól (Bowen és munkatársai), öt kontroll állatot hasonlóan kezeltek immunizálás nélkül. A kontroll állatok antigén A antitest titerje 3 állat esetében 1/20-nál kisebb volt, egy állatnál 1/80-ad és egy állatnál 1/1280-ad volt, míg az immunizált és védett állatok esetében a titer 1/80-ad és 1/640-ed között volt; átlagértéke 1/220-ad. Ezeket az értékeket az utolsó injekció beadása után 20 hónappal vett szérum mintákból állapítottuk meg. A szintek természetesen közvetlenül az injekció után magasabbak is lehettek. Öt évvel a kísérlet megkezdése után a négy kísérleti állatnál összesen négy fogszuvasodás esetet tapasztaltak. Az öt kontroll állatnál összesen hatvannégy fogszuvasodás esetet tapasztaltak, és a fogszuvasodások száma fordított arányban állt a szérumban levő antitest mennyiségével, a legnagyobb fokú szuvasodás annál a két állatnál következett be, melyek egyáltalán nem mutattak antitest választ. Kilenc évvel a kísérlet megkezdése után öt állat volt életben, miután kettő-kettő az immunizált és a kontrollcsoportból elpusztult. A három élő kontroll állat mindegyikénél erősen fokozódott a fogszuvasodás, 56, 69, 93 megtámadott fogfelületük volt. Az egyik immunizált állatnál egyetlen fog romlott el kismértékben, míg a másiknál fogszuvasodás egyáltalán nem következett be. 7. példa A tiszta antigén A immunogenitása A fenti eredményekből látható, hogy a teljes sejttel vagy baktérium sejtfallal a szervezetbe juttatott 5 antigén A és B alkalmas immunválasz kiváltására adjuváns nélkül (C csoport) vagy alumínium-hidroxid adjuváns egyidejű hozzáadásával (11. kísérlet). A tiszta antigénekkel való immunizáláskor azonban gyors és tartós hatás kiváltásához szükséges adjuváns 10 jelenléte is. Egyetlen majom immunválaszai (testsúlya körülbelül 5 kg), melyet 50 Mg antigén A-val immunizáltunk (az antigént a fent leírt ammónium-szulfátos kicsapással készítettük), alumínium-hidroxid hozzáadása mellett, a 2. ábrán láthatók. 15 Szabadalmi igénypontok 1. Eljárás emlősök fogszuvasodását gátló antigén 20 preparátumok előállítására Streptococcus mutans specieshez tartozó baktériumok tenyésztésével sejttenyészet előállítására szolgáló tenyészközegben, a tenyészetből legalább a sejtfalak eltávolításával és a kapott fehérjeoldatból az antigén preparátum elkü- 25 lönítésével, azzal jellemezve, hogy az antigén-preparátumot a fehérjeoldatból - kívánt esetben tisztítás céljából ammónium-szulfátos kicsapás után - affinitás kromatográfiával nyerjük ki immobilizált antitesten, ahol az immobilizált antitest egy vagy több anti- 30 génre specifikus és ezek az antigének (I) 29 000-es molekulasúlyúak és izoelektromos pontjuk 4,1-4,5, és I genetikus típusú Streptococcus mutans - kivéve a Streptococcus NC IB 11516 mikroorganizmust-sejtfalain maradnak 10 g/1 nátrium-dodecil-szulfát vízzel 35 készített forrásban lévő oldatával 20 percig tartó extrahálás után vagy (II) olyan fehérjék, amelyek szerológiailag reagálnak a fenti (I) csoportba tartozó antigén fehérjék antitestjeivel. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemez-40 ve, hogy a fehérjeoldatot az affinitáskromatográfiás kezelés előtt 45-65%-ig telítjük ammónium-szulfáttal, a kicsapódott szilárd részt elválasztjuk és újra feloldjuk, és az így kapott második fehérjeoldatot kezeljük affinitáskromatográfiával az immobilizált an- 45 titestekkel. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a fehérjeoldatot az affinitáskromatográfiás kezelés előtt körülbelül 45%ig telítjük ammónium-szulfáttal, a kicsapódott szi-50 lárd részt elválasztjuk, a visszamaradt fehérjeoldatból további ammónium-szulfát adagolással újabb szilárd anyagot csapunk le, amelyet elválasztunk és újra feloldunk, és az így kapott második fehérjeoldatot kezeljük affinitáskromatográfiásan az immobilizált 55 antitestekkel. 4. Eljárás fogszuvasodást gátló készítmény, (elsősorban vakcina, fogpaszta, vagy szájvíz) előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1-2. igénypontok bármelyike szerinti eljárással előállított antigén prepa-60 rátumot az egészségre ártalmatlan hordozó- és/vagy segédanyagokkal keverjük össze, és a keveréket készítménnyé szereljük ki. 1 db rajz 6
