190893. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fogszuvasodást gátló, fehérje jellegű antigén preparátumik előállítására
5 190.893 6 az Ingbritt-féle törzs tenyészetének szűrletében található fehérjéken; a szűrletet előzőleg ammóniumszulfátos kicsapással koncentráljuk. Két csapadék vonalat kapunk, melyek megfelelnek az ultrahanggal kezelt anyag és a felülúszó antigénjeinek. Bármelyik antigén preparátum nem-specifikus proteolitikus enzimmel való kezelése (Pronase, Sigma Chemical Co. gyártmány) azt eredményezi, hogy az antiszérum hozzáadás után csapadék nem képződik. Ez utóbbi kísérlet bizonyítja az antigének fehérjetermészetét. Az antiszérum hatását az ultrahanggal bontott sejtre és a tenyészet szürletére térhálósított anyagon végrehajtott immunoelektroforézissel vizsgálva - mely módszer érzékenyebb, mint az immundiffúziós - szintén csak két, az antigén/antitest kicsapási reakciónak megfelelő vonalat kapunk. Ugyanezt a két antigént mutathatjuk ki, ha más „c" szerotípusú törzset extrahálunk és abból állítunk elő a fent leírt módon antiszérumot. Ilyen törzs például az NCTC 10449-es számon az Országos Törzsgyűjteményben letétbe helyezett törzs (Colindale, Anglia). A két antigén fizikai tulajdonságairól térhálósított anyagon végrehajtott immunoelektroforézissel kaphatunk képet ; az első térirányban az elválasztást poliakrilamid gélen, izoelektromos tulajdonságok szerint (így a fehérjéket töltéskülönbségeik alapján választjuk szét), vagy NDS-poliaktilamid gélelektroforézissel (így a fehérjéket molekulasúlyuk alapján szeparáljuk) hajtjuk végre. Azt az eredményt kapjuk, hogy az antigén A izoelektromos pontja 4,3 és molekulasúlya 29 000±3 000, míg az antigén B izoelektromos pontja 5,4 és molekulasúlya közel 200 000. A pontosabb NDS-poliakrílamid gradiens gélelektroforézissel az antigén A molekulasúlyára 29 000-et, az antigén B-jére pedig 190 000-et kapunk. A molekulasúly meghatározásához standardként használt fehérjék a következők voltak: nyúl miozin, M = 200 000; /3-galaktozidáz, M = 116 000; foszforiláz A, szarvasmarha szérum albumin, M = 68 000; ovalbumin, M = 43 000; kimotripszinogén A, M = 25 700. Az antigén B molekulasúlyára kapott érték még nem tekinthető véglegesnek, mert a különböző futtatásos módszerekkel ki lehetett mutatni, hogy ez az anyag szénhidrátot és glikoproteineket is tartalmaz, melyekről ismeretes, hogy gélelektroforézis során rendellenesen vándorolnak. Az Ingbritt-féle törzs NDS-sel extrahált sejtjei hatására termelődött antiszérumot felhasználtuk annak bizonyítására is, hogy az antigén A-nak és B-nek megfelelő antigéneket termel 6 másik, a „c" szerotípusba tartozó törzs (ezek közé tartozik az FW293, a C67-1, a GS-5 és az OMZ-70, melyek leírása megtalálható: Russell RRB, Microbios Letters, 2, 55-59, [1976]), valamint egyes, az „e” (P4 törzs) és az „f” (151 törzs) szerotípusba tartozó törzsek is. Ez utóbbi két szerotípus ugyanabba a genetikus csoportba tartozik, mint a „c" szerotípus (a Coykendall szerinti osztályozás I genetikus csoportja, melyre a Streptococcus mutáns Clarke nevet j avasolták, [Coykendall. Int. J. Syst. Bacteriol., 27, 26-30m [1977]), és kimutatták, hogy antigén szempontból igen hasonlóak (Bratthall és munkatársai: J. Dent. Res., 55A, 60- 64, [1976] és Perch és munkatársai: Acta Path. Microbiol. Scand. Sec., B82, 357-370, [1974]) és hasonló fehérje összetételük van (Russell: Microbios Letters, 2, 55-59, [1976]). A „b" szerotípusba tartozó törzsek egy olyan antigént tartalmaznak, mely reakcióba lép az antigén A-val, míg az antigén B-vel reakcióba lépő antigének találhatók az „a", „d" és „g" szerotípusba tartozó törzsekben és a Streptococcus sanguis törzsekben 3. példa Tisztított antigén A előállítása Az antigén A-nak és B-nek tenyészetek szűrletéből való kimutatását követő kísérletek azt bizonyították, hogy mindkét antigén a sejtnövekedés során termelődik, akárTodd-Hewitt tápközeget, akár tripton/élesztő extraktot, akár pedig ismert kémiai összetételű (IKÖ) tápközeget használtunk, melyet Janda és Kuramitsu szerint állítottunk elő (Infect. Immun., 14, 191-202, [1976]). Mivel az IKÖ tápközeg kevesebb, a tisztítást megnehezítő anyagot tartalmaz, a kísérletek céljára ezt választottuk ki. Ingbritt-féle Streptococcus mutáns törzset IKÖ tápközegen tenyésztünk a korai stacionárius fázis eléréséig, majd a sejteket eltávolítjuk centrifugálással és üvegszűrőn való szűréssel. Ha elő akarjuk állítani a tiszta antigén B-t, a szűrletet oldhatatlan mutan glükózpolimerrel és poliakrilamid gél gyöngyökkel (BioGel P2) töltött kromatográfiás oszlopon engedjük át a glükoziltranszferáz enzimek eltávolítása céljából, melyek hajlamosak a tisztítás során is együtt maradni az antigén B-vel. Az oszlopot McCabe és Smith szerint készíthetjük el (Infect. Immun., 16, 760-765, [1977]). Az oldathoz lassan szilárd ammónium-szulfátot adunk a 45%-os telítettség eléréséig, majd egy éjszakán át 4 °C-on állni hagyjuk és a képződött csapadékot centrifugálással elkülönítjük. Az előzetes kísérletek azt mutatták, hogy az antigén B legjobban a 45%-ra telített ammónium-szulfát oldatban csapódik ki, míg az antigén A kicsapódásához legelőnyösebb a 65Tora telített ammónium-szulfát oldat. Az oldathoz ezért további ammónium-szulfátot adunk a 65%-os telítettség eléréséig, és újra összegyűjtjük a csapadékot. Mindkét frakciót 7,5 pH-jú 50 mM trisz-sósav pufferrel szemben dializáljuk a következő lépés, a DEAE térhálósított dextránon való kromatografálás előtt (DEAE Sephadex A 25). Végig a tisztítás során ugyanezt a puffert használjuk. A mintákat előzetesen trisz pufferrel ekvilibrált külön oszlopokra visszük fel. Az eluálást úgy hajtjuk végre, hogy az oszlopon keresztül engedünk egy térfogatnyi trisz puffert, majd fokozatosan 0-tól 0,3 M-os trisz pufferes nátrium-klorid oldatot. A frakciókat összegyűjtjük és NDS-poliakrilamid lemez gélelektroforézissel és kombinált immunoelektroforézissel analizáljuk NDS-sel extrahált sejtekkel előállított antiszérummal szemben. A 45%-ig telített ammónium-szulfátos oldatból származó antigén B körülbelül 0,8 M nátrium-kloriddal eluálódik, míg az antigén A körülbelül 0,13 M nátrium-kloriddal eluálódik. Mindkét esetben 90%ra becsültük az antigén fehérjék tisztaságát. Az antigént tartalmazó frakciókat összegyűjtjük, trisz pufferrel szemben dializáljuk és ultraszűréssel töményítjük. A részlegesen tisztított antigéneket ezután agaróz gél oszlopra visszük (Sepharose CL-6B) és trisz pufferrel eluáljuk. A frakciókat összegyűjtjük és elemezzük az antigének és a fehérjeösszetétel szempontjából. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
