190893. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fogszuvasodást gátló, fehérje jellegű antigén preparátumik előállítására
3 190.893 4 Az antigén A-t ismert módszerekkel, előnyösen ammónium-szulfátos lecsapással, majd azt követő kromatografálással nyerhetjük ki a fehérjeoldatból. Az ammónium-szulfátos lecsapást végrehajthatjuk egy lépésben, az oldatot célszerűen 65%-ra telítve, de ennél előnyösebb két lépésben való végrehajtása, az első fázisban 45%-ra, a másodikban pedig 65%-ra telítve az oldatot. Az első lépésben kapott csapadék kis mennyiségű antigén A-t tartalmaz, a második lépésben kapott csapadék tartalmazza az antigén A túlnyomó részét, emellett kisebb mennyiségben más fehérjéket is, például antigén B-t is tartalmaz. Az antigén A-t kromatográfiás módszerrel nyerhetjük ki a második lépésben nyert csapadékból vagy mindkét lépés csapadékából, a gazdaságosságtól függően. A kromatográfiás elválasztást bármely alkalmas anyagon végrehajthatjuk; alkalmazhatunk például térhálósított dextrán vagy agaróz gélt vagy dextránnal szubsztituált triazin-festéket agaróz gélen immobilizált formában. Különösen előnyös a dietilaminoetillel térhálósított dextrán alkalmazása. A fehérjéket a szokásos módon, a pH vagy az ionerősség fokozatos változtatásával eluálhatjuk; előnyös az ionerősség nátriumkloriddal való változtatása, mely esetben az antigén A-t 0,1-0,2 molaritású nátrium-kloriddal eluáljuk. Ezen kívül alkalmazhatunk affinitás-kromatográfiát vagy immunadszorbens-kromatográfiát is az antigén A kinyerésére; kromatografálhatjuk az ammónium-szulfátos lecsapással nyert csapadékot vagy a nyers sejtextraktumot és/vagy a felülúszót. A legelőnyösebb módszer az antigén A elválasztására a fehérjeoldatból az immobilizált anti-antigén A antitestek alkalmazásával végrehajtott affinitáskromatográfia. Az antitestek lehetnek valamely megfelelő állatban, például nyúlban termelődött immunoglobulin G (IgG) antitestek, melyeket szokásos módszerrel, például térhálósított agaróz gyöngyökön immobilizálunk, majd brőmciánnal aktivizálunk. A tisztított antigén A preparátumot a gyógyászatban szokásos hordozó- és segédanyagokkal vakcinává alakíthatjuk; ilyen segédanyagok például az adjuvánsok (például az alumínium-hidroxid), a stabilizáló anyagok és a bakteriosztatikumok. A vakcina a Streptococcus mutáns egy vagy több törzséből származó fehérjéket tartalmaz és embereknek, valamint emlős állatoknak beadható szubkután, intramuszkulárisan, intravénásán vagy nyálkahártya alatt, általában 1-50, legelőnyösebben 10 Mg testsúlykilogramm dózisban. Több injekció beadására is szükség lehet a megfelelő antitest-válasz kiváltásához. Védettséget lehet elérni az orálisan, például az antigént tartalmazó kapszulák lenyelésével végrehajtott immunizálással is. A találmány szerinti, az emlősök fogszuvasodásának megelőzésére vagy gátlására szolgáló készítmény másik formája az antigén A antitestjeit tartalmazza a gyógyászatban szokásos valamilyen formában. A készítmény lehet injekció, vagy formulázható helyi alkalmazásra megfelelő formában, például fogpaszta vagy szájvíz alakjában. A készítmény vagy csak az antigén A antitestjeit, vagy más Streptococcus mutáns antigének antitestjeit is tartalmazza. Az antitesteket szokásos módon, Streptococcus mutáns antigén készítményeket - beleértve az antigén A-t is - megfelelő állatokba, például tehenekbe vagy nyulakba fecskendezve állíthatjuk elő. Az alkalmazható antigén készítmények közé tartozik elsősorban az NDS- sel mosott sejtfal-preparátum és a fent leírt módon előállított tisztított antigén A. A leírt találmány szerinti készítmények hatása az antigén A antitestjeinek köszönhető, akár jelen vannak azok a beadott készítményben, akár pedig kezelt szervezetben képződnek immunválasz révén. A fogszuvasodást megelőző antitestek hatásmechanizmusa nem teljesen tisztázott, de ez nem gátolja a találmány gyakorlati alkalmazását. Lehetséges, hogy a szóbanforgó antitestek a baktériumsejtek anyagcseréjét befolyásolják, és a glukán vagy a sav képződését gátolják. A hatásmechanizmusukra vonatkozó egyes feltevések azonban semmiképpen nem befolyásolják a találmány oltalmi körét. Az oltalmi kör továbbá nem korlátozódik a leírásban felsorolt és a példákban említett Streptococcus mutans törzsekre. Az alábbiakban példákkal szemléltetjük a találmány szerinti jellegzetes eljárásokat és készítményeket. Az 1. ábra az immunizált („a” görbe) és a kontroll („b" görbe) állatok antigén A-val kiváltott IgG válaszait mutatja. A 2. ábra az antigén A által kiváltott IgG válaszokat mutatja egyetlen állat esetében. 1. példa NDS-sel extrahált sejtfalak antiszérumának előállítása A jól ismert Ingbritt Streptococcus mutáns törzset használjuk. A törzs leírása megtalálható Krasse, B.: Archs. Oral Bioi., 11, 429-436, és Coykendal rendszere szerint az I genetikus csoportba (J. Gen. Microbiol., 83, 327-338, 1974), Bratthall osztályozása szerint pedig a „c” szerotípusba (Ódont, Revy, 20, 231— 243,1969) tartozik. A törzs deponálva van az NCIB- nél, Aberdeen-ben, Skóciában, az NCIB 11516 deponálási számon. A baktériumokat Todd-Hewitt tápközegen tenyésztjük (Todd, E. W., Hewitt, L. F.: J. Path, and Bacteriol., 35, 973-974, (1932), a stacionárius fázis eléréséig (16 óra). Ezután a sejteket centrifugálással kinyerjük és forró vízfürdőn 20 percig szuszpendáljuk nátrium-dodecil-szulfát (NDS) szolubilizálő pufferben (Laemmli: Nature, 227, 680-685, [1970]). Ezután a sejteket centrifugálva vízzel mossuk, fagyasztva szárítjuk és vízzel 10 mg/ml koncentrációjú szuszpenziót készítünk belőlük. Ezekkel az NDS-sel extrahált sejtekkel nyulat immunizálunk úgy, hogy a szuszpenziói ml-ét0,l ml alumínium-hidroxid adjuvánssal keverjük. Ilyen keveréket adunk be a nyulaknak intramuszkulárisan a nulladik, huszonegyedik és negyvennyolcadik napon. Az ötvenötödik napon a nyulat szívpunkcióval elvéreztetjük. Hasonló eredményt kapunk akkor is, ha a sejteket NDS 10 g/1 koncentrációjú vizes oldatával extraháljuk forralva 20 percig vagy szobahőmérsékleten 1 óra hosszat. 2. példa Az antigén A és antigén B jellemzése Az 1. példában leírt módon előállított antiszérum hatását immunodiffúziós módszerrel vizsgáljuk az Ingbritt-féle törzs sejtalkotóin (a teljes sejtekből ultrahangos bontással előállított extrakt formájában) és 3 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
