190893. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fogszuvasodást gátló, fehérje jellegű antigén preparátumik előállítására
1 190.893 2 A találmány tárgya eljárás a fogszuvasodást gátló, fehérje jellegű antigén preparátumok előállítására, és a preparátumokat vagy antitestjeiket tartalmazó készítmények előállítására. Általánosan ismert, hogy a fogszuvasodást a fogak felületén élő baktériumok által termelt sav okozza; a baktériumok elsősorban a Streptococcus mutans fajba tartoznak. Ennek a felismerésnek a következményeképp számos kísérletet tettek a fogszuvasodás megelőzésére vagy legalább csökkentésére a Streptococcus mutans teljes sejtjeinek vagy sejtalkotóinak felhasználásával történő immunizálással. Ilyen kísérleteket írnak le például a következő cikkekben: Bowen és munkatársai British Dental Journal. 139, 45- 48 (1975) és Cohen és munkatársai British Dental Journal, 147, 9-14 (1979). A kísérletek során a majmok fogszuvasodását sikerült csökkenteni teljes sejtekkel vagy centrifugálással felbontott sejtekből nyert, sejtfalban gazdag anyaggal végrehajtott immunizálással. (A glukoziltranszferáz enzimpreparátumokkal való immunizálás nem nyújtott védelmet.) Bár kimutatták. hogy az ilyen immunizálás immunválasz - a Streptococcus mutans baktériumok antitestjeinek termelődése - kiváltása révén hat, nem tudjuk biztosan. hogy a keletkezett antitestek hogyan jutnak el a szájban levő baktériumtelephez. A szájban, a nyálkahártya alatt és a lábszáron, bőr alatt alkalmazott immunizálás egyaránt védelmet nyújtott. Egy lehetséges. bár valószínűleg drágább eljárás az antitest preparátumok helyi alkalmazása például a Streptococcus mutáns antigének antitestjeit tartalmazó tej formájában (1 505 513. számú nagy-britanniai szabadalmi leírás). Bár úgy látszik, hogy a teljes Streptococcos mutáns sejtekkel vagy azokból készített sejtfal-preparátumokkal végrehajtott immunizálás védelmet nyújt a fogszuvasodás ellen, a módszer alkalmazása - különösen élő, teljes sejtek felhasználása esetén - bizonyos kockázattal is jár. A Streptococcusokról ismeretes. hogy szerepük van egyes betegségek, például a reumatikus szívfájdalmak keletkezésében, és a teljes sejtekkel, de még a sejtalkotókkal végrehajtott immunizálás is a nemkívánatos mellékhatások növekedését okozhatja. Ezért a legnagyobb biztonság és a legnagyobb hatékonyság érdekében egyaránt az a legkedvezőbb, ha a fogszuvasodás elleni vakcina csak a védelem biztosításához szükséges specifikus antigént vagy antigéneket tartalmazza. Azonosítottunk két antigén fehérjét (a továbbiakban antigén A-nak és antigén B-nek nevezzük őket), melyek jelen vannak a fent említett sejtfal-preparátumokban és melyeknek valószínűleg szerepük van a fogszuvasodás gátlásában. Az antigén B-ről már korábban kimutatták, hogy olyan antitestek képződését serkenti, melyek reagálnak az emberi szív szövetével (Hughes: Pathogenic Streptococci, 222-223, kiadta M. T. Parker, Reedbooks. Chertsey, Anglia, 1979). Az a veszély, hogy antigén B tartalmú vakcinák alkalmazása a szívre káros autoimmun-választ váltana ki, lehetetlenné teszi az antigén B alkalmazását jelenleg ismert formájában vakcinák hatóanyagaként. A találmány szerinti módon előállított antigén készítmény a Streptococcus mutáns antigénfehérjéi közül csak - az alábbiakban definiálandó - antigén 2 A-t tartalmazza. A találmány szerinti eljárással továbbá olyan gyógyszerkészítmények is előállíthatok, melyek egy ilyen antigén készítményt vagy annak antitestjeit tartalmazzák gyógyászatiig elfogadható segédanyagokkal kombinálva. A „gyógyszerkészítmény” kifejezés alatt a megelőzésre alkalmas, profilaktikus szereket, például vakcinákat, és a fertőzést követően, a fertőzés hatásának csökkentésére beadott szereket értjük. Az antigén A molekulasúlya 29000±3000 és izoelektromos pontja 4,1-4,5. A Streptoccus mutáns „c" szerotípusának (Bratthall: Ódont Revy, 20, 231- 243 [1969] szerint), melybe például az NCTC törzs is tartozik, sejtfalából nyerhető oly módon, hogy a sejteket nátrium-dodecil-szulfát (NDS) 10 g/1 koncentrációjú vizes oldatával extraháljuk szobahőmérsékleten 1 óra hosszat vagy forralás közben 20 percig. Az antigén A a sejtfalban visszamarad. Lényegében azonos fehérjéket találtak más, az I genetikus csoportba tartozó Streptococcus mutáns törzsek sejtjeiben is (Coykendall: J. Gén. Mikrobiol, 83, 327-338); idetartoznak az „e" és „f szerotípusok, például a Russell által leírt törzsek is (Microbiol. Letters, 2, 55-59, 1976). Hasonló antigén fehérjéket találtak más genetikus csoportba tartozó, például „b" szerotípusú törzseknél is. Jelen találmány ilyen antigén fehérjékre vonatkozik, és ezeket foglalja magában a leírásban és az igénypontokban alkalmazott „antigén A" kifejezés. így a találmány szerinti megoldás nincs bizonyos speciális törzsekre korlátozva. Az antigén A-t nem könnyű elválasztani az NDS- sel extrahált sejtfalakból, de nyulak immunizálása az extrahált sejtfal-preparátummal két fehérje, az antigén A és az antigén B antiszérumának keletkezését eredményezi; ezáltal ezek kimutathatók és elválaszthatók a teljes sejtből extrahálással készített anyagból vagy a sejtmentesített szűrletből. Az antigén így egyszerűen előállítható tenyészetek szűrletéből vagy magukból a tenyészetekből előzetes sejtbontás után. A találmány szerint az antigén A-t úgy állítjuk elő, hogy Streptococcus mutáns baktériumokat megfelelő tápközegen tenyésztünk, a kapott tenyészetből legalább a baktériumok sejtfalát eltávolítjuk, és a kapott fehérjeoldatból elválasztjuk az antigén A-t. Tápközegként bármely, a Streptococcus mutans tenyésztésére alkalmas tápközeget használhatunk, például Todd-Hewitt tápközeget (Todd, E. W., Hewitt, L. F.: J. Path, and Bacteriol., 35, 973-974 [1932]), vagy tripton/élesztő extraktot vagy kémiailagelőállított, ismert összetételű táptalajt. Ez utóbbi alkalmazása megkönnyíti a termék tisztítását. A tenyésztés folyamán az antigén A folyamatosan keletkezik és a táptalajba jut. A sejteket előnyösen a korai stacionárius fázisban dolgozzuk fel (15-25 óra, 37 °C- on). A sejteket folyamatosan is tenyészthetjük. A fehérjeoldat tartalmazhatja egyszerűen a tenyészet szűrletét, melyet a teljes sejtek eltávolításával nyerünk vagy tartalmazhat a sejtfalaktól és sejttöredékektől megtisztított sejtextraktumot, vagy lehet ezek keveréke, melyet úgy állítunk elő, hogy a tenyészet sejtjeit megbontjuk, majd eltávolítjuk a sejtfalakat és sejttöredékeket. A sejtfalakat eltávolíthatjuk a sejtek egészben való eltávolításával, vagy töredékként a sejt felbontása után, ismert módszerekkel, például centrifugálással vagy szűréssel. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
